一、原理
福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸,在碱性条件下极不稳定,易被酚♂类化合物还原为蓝色化合物(钨蓝和钼@ 蓝)。
蛋白质中含具酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸),用胰蛋白酶水解蛋白底物,生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应,生成蓝色化合物,在一定的范围内,蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
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二、实验仪器
试管
7220分光光度计
恒温水浴锅
三、实验试剂
1.福林试剂B:见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)
2.0.55mol/L碳酸钠溶液:58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水◤,稀释并︻定容至1000ml
3.10%三氯乙酸溶液
4.0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5):
5.0.5% 酪素溶液:称取0.5g酪素,以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润,再加少量0. 2mol/L磷酸缓冲液稀释。在水浴中煮沸溶解,冷却,稀释并容至100ml,冷藏在(冰箱)里。
6.500ug/L酪氨酸溶液〇
7. 胰蛋白酶◣溶液(冰箱中)
四、实验步骤
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各管中加0.5%酪素2ml,于37℃水浴中反应15分钟,然后加入10%三氯乙酸3ml,过滤除去沉淀,取清液1ml,加入0.55mol/L碳酸钠5ml,再加入福林试剂1ml,于37 ℃水浴中显色15分钟,测OD680。
以光密度为纵坐标,酪氨酸的微克数为横ㄨ坐标绘制标准曲线。
样品测定:取干燥的▃试管2支,
五、结果计算
酶活力:在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。
样品中含酶活力单位=A/15 ╳F
A—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数
F—酶液稀释倍数