细胞培养知识（一） 
1 冷冻管应如何解冻？ 
取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。 

2 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？ 
除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜→培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴⌒　附之问题。 

3 可否▃使用与原先培养条件不同之培养基？ 
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和ω　原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。 

4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞∏无法存活。 

5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

6 培』养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？ 
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养▽基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。

7 何时须更换培养基？ 
视细胞生长密〓度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。

8 培养基中是否须添加抗生素？ 
除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。

9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处︽理？ 一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于-20 °C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。 

10 悬浮性细胞应如何继代处理？ 
一般仅需持续加入新鲜培︾养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。 

11 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率∏应为多少转速？
欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。 

12 细胞之接种密度为何？ 
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例∏接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。 

13 细胞冷冻培养基之成份为何？ 
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞¤液中， 必须使用前先行配制完成。 

14 DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？ 
冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4°C， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。 

15 冷冻保存细胞之方法◥？ 
冷冻保◣存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟＊) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。 冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序▂之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至-80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。＊-20 °C 不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。 

16 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。 

17 应如何避免细胞污染？ 
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。 

18 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？ 
直接灭菌后丢弃之。 

19 支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？ 
不能。除极有经验之∩专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。 

20 支原体污染会对细胞培养有何影响？ 
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细〒胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。 

21 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何←处理？直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 

22 CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？ 
定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。 

23 为何培养基保存于4 °C 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越◥来越偏碱性？ 
培养基保存于4 °C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH 值。 

24 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？ 
不同厂牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有卐太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。 

25 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？ 
研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程【操作上的失误， 造成细胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生◣长隔夜后再更换培养基即可。 

26 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？ 
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不→佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细◇胞解冻后， 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于-80 °C 太久。 

27 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？ 
冷冻管瓶盖裂纹№，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹︻取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。 

细胞培养知识（二） 
无菌操作基本技术 
1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培⌒养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行卐下一个细胞株之操作。 
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完√即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70% ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 
3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污∩染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 
4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细∑　胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作〗过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 
5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 
6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。

实验用品 
1. 种类? 
1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。 
1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等，依实╳验需要使用。 
1.3. plastic sterile pipet: 1ml, 2ml,5ml, 10ml, 25ml 
1.4. 塑料离心管: 15ml, 50ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP) 为不透明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 
1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100ml, 250ml,500ml,1000ml 
2. 清洗? 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。 
3. 灭菌? 
3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，置于oven 中烘干。 
3.2. 实验用玻璃pasteur pipet 以干热灭菌170℃, 4 小时。 
3.3. 液体或是固体废弃物可用10% hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高压灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟处理。

培养基 
1. 液体培养基贮存于4℃冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水槽中温热。 
2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。 
3. 粉末培养基配制(以1 升为例)： 
3.1. 细胞培养基通常须添加10% 血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml，pH 为7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。 3.2. 材料： 
3.2.1. 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品╱质非常重要) 
3.2.2. 粉末培养基 
3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019) 
3.2.4. 电磁搅拌▓器 
3.2.5. 无菌血清瓶 
3.2.6. 0.1 或0.2 mm无菌过滤膜 
3.2.7. pH meter 
3.2.8. 真空帮浦 
3.2.9. CO2 气体
3.3. 步骤： 
3.3.1. 取粉末培养基溶于700ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。 
3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于200ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。 
3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH 会升高0.1-0.2。 
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。(血清亦可加入培养基中一起过滤) 
3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。 
4. 配制培养基之生长测试 
4.1. 材料： 
4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) 
4.1.3. methanol 
4.1.4. glacial acetic acid 
4.1.5. 10% Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013) 
4.2. 步骤： 
4.2.1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每个well 接种1 × 102 活细胞，同时作对照组实验。 
4.2.2. 接种5～7 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞∴群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。 4.2.3. 去除培养基，加入1ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸? 3:1)，室温下↘静置10 min。 
4.2.4. 去除固定液，水洗二次。 
4.2.5. 加入1ml 10% Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液，水洗二次。
4.2.7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批⊙号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。 

细胞培养知识（三） 
如何选用特殊细胞系培养基？ 
培养某一类型细胞没有固★定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞∏培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIM V（12005）培养基（SFM）。 

L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ 
L-谷氨酰胺在细胞培养①时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作㊣为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 

GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ 
GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺》的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨』酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条¤件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。 

什么培养基中可以省去加酚红？ 
酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为】黄色，碱性时〒为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素∑）。为避免固♀醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰▲检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 如何用台盼兰计数活细胞？ 用无血清培养基〖把细胞悬液稀释到200～2000个/毫升，在0.1毫升的细胞悬液中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血卐球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。 

如何消除组织培养的污染？ 
当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。 高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性∞，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。 1. 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释◥细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。 2. 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。 3. 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。4. 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒ζ　性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。 5. 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。 6. 重复步骤4。 7. 在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。 

培养基中丙酮酸钠的作用是什么？ 
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话【，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

细胞培养知识（四） 
1.如何选①用培养基？
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。

2.为什么要热灭活血清？
加热可以灭活补』体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭◆活血清。 

3.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？
它在溶液中不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I是什么？
培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。

5.为什么培养基中可以省去加酚红？
酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

6.如何用台盼兰计数活细胞？ 
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

7.如何消除组织培养的污染？
当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
2)分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3)每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
4)确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。
5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6)重复步骤4。
7)在无抗生素的培养基中培养4-6代，确定污染是否以已被消除。

8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

9.Hank’s 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？
Hank’s 平衡盐溶液（HBS）和Earle’s平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？ HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸◥氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变¤酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的◇组织，用Hanks液就可以了。

10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别?
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：End-Point Determination of Endotoxin Content噬菌体检验生物化学检测 激素的检测血红蛋白检测Sf9 细胞生长促进及方法学检测

11.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？ 
二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

12.制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗？ 
是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100μl OPTI-MEM中，稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基（800μl）。（注意以上是35mm培养皿使用体积）。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。

13.我使用SF900 Ⅱ时，细胞生长良好，但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好？ 
如果目的蛋白是一个后期蛋√白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无ω血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清（少于1％），让血清∩给蛋白酶提供作用底物。 

14.如何检测内毒素(热源)水平？
LAL（Limulus Amebocyte Lysate）试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现※细菌可引起鲎（Limulus polyphemus）血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统（丝氨酸蛋白酶级联反应系统），通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，LAL中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎（血细胞）裂解物。胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island，按照①手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟，以消除抑制剂。（通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与LAL反应。样品预先□　热处理可以消除这种抑制作用。）

15.我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗？ 
如果使用固体形式的培养基，需要☆加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入卐到MS培养基中。

16. 20℃下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH值会改变吗？
对于普★通使用的缓冲液，PH值随温度变化而变化。下表列出温度改变10℃时，PH值的√变化情况例如 20℃下配制PH7.4 Tris缓冲液,40℃时PH值为 7.4-（2x0.310）＝6.7817. 室温下(25℃)配制的

17.Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少？
缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同的PH值。

18. 昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少？
生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影①响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值 6.0-6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最适渗透压是 345-380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。

19. High Five细胞有任何其它名称吗？
High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

20.在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少？ 
High Five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。 

21.High Five细胞用多大的密度冻存？
3.0x10E6 cells/ml 

22.在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么？对我的细胞有害吗？ 
可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸→沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典◥型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实∏验不会有不利的影响。 

23.如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？ 
我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性最小，生活力最高。通过使用巴氏德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在Ψ绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：1)去除培养基。2) 用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS.3) 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。4) 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。5) 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥※形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。）6) 离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。7) 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。 24.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？ 为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。 25.如何评估ES细胞合格的胎牛血清？ 使用D3 ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长∑　抑制和分化因子非常敏感的细胞系。相关生长效率分析：当ES细胞以非常低的密度传入包含10％胎牛血清的生长培养基中，检↙测开始和支持ES细胞克隆的∑能力。细胞毒分析：当以非常低的密度传入包含30％胎牛血清的生长培养基中，检测ES细胞和feeder细胞的生长能力。相关形态学和分化分析：检测胎牛血清支持未分化ES细胞】克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红，分化的细胞较大，丰满，颜色较浅。所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的，培养基中出现ESGRO会掩盖由胎牛血清所导致的问题。（ESGRO或LIF经常用来保持ES细胞处于未分化状态。）经过培养发现，大约8批中有1批可以用来培养ES细胞。

26.在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？
通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候记数时，都应该检查细胞活力。如果超过95％的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。