摘要：我国的临床分子诊断试剂经历了分子杂交、聚合酶链反应（PCR）琼脂糖凝胶电泳、PCR酶联免疫→吸附试验（ELISA）和实时荧光PCR等发展历程，对操作简单化的追求，影响了试剂的重复性和敏感性。个体『化医学检测的发展，使得依赖于不同检测平台的分子诊断试剂正在不断出现，如PCR Luminex、PCR测序和高分辨熔点曲线分析等。目前及今后相当长一段时▃间内，我国的临床分子诊断操作仍将以手工操作为主，并且应有自配试剂。如何开发适用于基层医疗∑ 机构临床实验室的分子诊ξ 断试剂是值得去思考的一个问题，检测的自动化无疑是一个◥发展方向。
一提到分子诊断，人们自然会想到核酸和基因。的确，分子诊断技术的发展与分子生物学的研究是分不开的，自1953年Watson和Crick发现DNA双螺旋结构ω 以来，一系列分子生物学新技术相继出现，如Sanger测序、放射性核素和⊙非放射性核素标记技术、电泳、层析、核酸纯化、核酸液相和固相杂交、基『因工程技术、限制性酶】切、聚合酶链反应（PCR）技术、毛细管电△泳、实时荧光PCR、基因芯片、质谱、新一代测序等。这些技术为临床分子诊断手段的发展提供了源源不断的动力□和无限的想象空间，并在应用中不断地成熟，使得临床分子诊断成为检验医学最有活力一个的领域，是当今个体化医疗迅速发∮展的支撑，其具体表现形式就是各种用于特定疾病诊断和治疗的临床々分子诊断试剂。
一、历史
我国的临床分子诊断试剂的出现，最早可以①回溯到上世纪80年代，较国外晚10年左右，当时︼国外主要用于遗传病的诊断，我国则主要用于乙型肝炎等传染病的检测，这与我国人ㄨ群乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）的感染率高，乙型肝炎患者较多是分不开的。那时，主要是采用硝酸纤维素膜上斑点杂交方法，探针采用32P标记，杂交完成后，通【过放射自显影显示结果，后来，逐步发展到采用生物素或地高辛等非同位素标记♀。上世纪90年代以前，在我国涉及乙型肝炎治疗〓的医院临床实验室应用核酸斑点杂交检测HBV DNA相当普遍。斑点杂交技术√的特点是简单方便，但检测敏感◥性低，今天看来，将其◣用于对检测灵敏度要求较高的病原体的检测并不合适。1983年，美国Cetus公司的Mullis发明了PCR技术，其利用DNA高温变性和低温复性的基本原理，通过变性、复性◣和延伸3个温度变化，成功实现了DNA在体外的复制。但该技术最←初由于每一扩增循环均需加入DNA聚合酶（因◤其不耐热），实际应用受到限制，成为PCR应用于疾病诊断的瓶颈∴，随后几年，该公司成功从美国黄石国家公园温泉中分离到的嗜热菌中◢得到了耐热的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶），1989年被美国Science杂志命名第一个ぷ“年度分子”使PCR临床应用的↘瓶颈问题迎刃而解，从而使得PCR成为临床分子诊断和生命科学研究中的一个革命性技术，预示着分子时代的到来。因此到90年代初期，国内╳一批研究人员迅即将这一技术用于HBV的临床检▆测，出现一大批生产PCR试剂的公司，采用的╱基本技术是PCR琼脂糖凝胶电泳方法，靶核酸经PCR扩增后，会出现一定长度片段的特异扩增产物，电泳分离后，经溴化乙啶√染色，紫外线下可见相应的分子大小的条带。到90年代中期，又有一些厂家，生产了PCR板上杂交即』PCR酶联免疫吸附试验（ELISA）方法。但由于PCR琼脂糖凝胶电泳和PCR ELISA均为PCR后有一个开管取扩增产物进行分析的过程，极容易出现扩增产物〒被“污染”所致的假阳ㄨ性结果，临床反映强烈，直接导致1998年4月卫生部下文⌒ 暂停了PCR检→验在临床中的应用。其实在90年代中期，国内一些企业已意识到这种假阳性带来的⌒ 问题，开始研发实时荧光PCR检测试剂，并用于临床检测。
二、现状及问题
临床检验的发展方向无疑是自动化，临床分□ 子诊断亦是如此。自动化带来了“检测系统”的概念，即检☆测仪器、试剂和校准品的一体化，从而避免了同一试剂在不同实验∏室配不同仪器所带来的♂结果不确定的问题，但由于我国整体工业水平（尤其是原材▼料工业和精密加工工业）与西方发达国家的差距，在国产仪器设备的基础实现临床检验的自▽动化尚需时日，临床分子诊断尤甚。因此，目前我国的临床分子诊断在核酸提取、扩增反应液准备、扩增前◆加样、上机、产物分析和结果分析报告等方面仍是以手◎工操作为主。
分子诊断中繁杂且要求精细的手工操作步骤，使得临床实验室工作人员总在不〗断追求操作步骤简↙单的试剂，试剂生产厂家为满足用户的这种需求，也在努〗力追求操作简单化，于是一些只需要简单核酸提取或不需核酸提取、最少试剂配制的检测试剂应时而生。如目前在㊣国内广泛使用的HBV DNA实时荧光PCR试剂。任何一件产¤品，如果生产过程只是追求简单，则一定会以质量下降为ω 代价。因此，国内的用于传∏染病检测的PCR试剂如HBV DNA、丙型肝炎病毒RNA（HVC RNA）和人类免疫缺陷病毒＠-1RNA（HIV-1 RNA）定量检测，与国外同类试剂盒相比较，一直存在重复】性、分析敏感性和抗干扰（溶血、黄疸、脂血等）能力差等问题。存在这些问题的最根本原因主要在于核酸提取，荧光PCR扩增阶段的试剂水平与国外并无太大差距。临床标本中可能存在血红蛋白、乳铁蛋白、免疫▲球蛋白G（IgG）、胆红素、血脂等均々是PCR扩增反应的抑制〓剂，是否能有效地将这些◎抑制物从标本中去除，决定了后续的PCR扩增效率。核酸提◣取方法过于简单，则无法将这些抑制物有效▂去除，直接影︽响后面的扩增检测结果，影响上述检测性能。而且，也因为这些抑制物的存在，无法在扩增检测时加大样本加入量。样本加入量小，一是加样的重复性◥和准确性都相对较差，最后会反映在整个检测的重复性差；二是直接影响】分析敏感性。作为PCR扩增来说，从理论上讲↓，每个反应管内至少有1个分子，才会出现扩〓增，加样量少，在标本内相应靶核酸含量少的情况下，则取得1个以上靶分子的∩可能性也小，反之越大。相对于传染性病原体核酸检测来说，人的基因检测试剂在上述方面问题相对较少，因为人的基因含量高，一般不存在因标本中基因组含量少而影响检测敏感性的问题，通常的核酸提取方法均可达到相应要求。
近年来，随着药物基因组学和肿瘤靶々向治疗等的研≡究进展，与个体化治疗用药相关的基因多态性、基因突◤变和基因量的变化等的检测正迅速走向临床应∞用。国内众多厂家正在采用各种方法开发商品试剂，如基于实时荧◣光PCR的方法、PCR杂交（硝酸纤维素膜、乳胶颗粒如Luminex、玻片如基因芯片等）、PCR-测序（双←脱氧测序、焦磷酸测序、新一代测序█如Illumina、Ion torrent等）和PCR高分辨熔点曲线分析（HRM）等，技术多☉种多样，各有特点，有的对〇实验室分区和操作人员的要求较高，对广大基层╲实验室来说，较难◣实际应用。因此，作为临床实验室如何判断一种试剂方法能否有效地用于日常检测，最重要◣的是在自己实验室条件，对相应的试剂方法进行性能验证，主要的性能指标有重复性、准确性、特异性、检测限和抗干扰能力等，这些性能指标中◇最重要的是重复性，其是准确性的前提。评价重复性№的1个简单方法是，选择不同强弱阳性及阴性的ㄨ数份样本进行20次批内和↑批间测定，看是否能得到相同的结果。如否，需寻→找原因，排除实验室环境条件及人员操作的因素，如果确认属于试剂或方法的问题，则该试剂或方法就不具备临床实用性，不能用于临床检测。
三、展望
随着对人类基因及其结↓构改变、基因表达或表达产物代谢异常与疾病的发生、发展和药物作□ 用上的研究进展，分子诊断不只是涉及DNA和RNA，也涉⌒及蛋白组学和代谢组学检测。检测方法学的进▲步，使得因疾病而改变的基因及其结构改变的谱、基因表达〇谱（RNA和蛋白谱）、代谢通路上的小分子谱的检测变得容易，将出现一大批可用于临床疾病诊治的分子诊断标√志物，使人类对疾病的认识，由点入面，最后得到1个清晰的全景图像，治疗成为有的放矢，使得患者疾病的治疗进入∩到真正的个体化』时代。由上述可见，实验室检测尤其是分子诊断的准确性对于个体化医学时代患者疾病的诊治的重要意义。
1.方法学的●更新换代 尽管在国内外文献上发表的↙分子诊断方法很多，并且还在不断出现，也有不少人尝试将用于临床诊断，但随着时间的推移，一些在临床实★际检测中证明重复性不好的只适用于科研的方法，将¤会被完全淘汰。有些方法，在对操作者有严格训练★的情况下，可得到好的重复性，但很难广为推广∏应用，只适用于个别实验室自配试剂使用。适用于＠广大基层临床实验室的检测方法，通常应具备以下特征：（1）对实验室的分区要求低；（2）对人员的操作ξ的精确度要求不高；（3）结果分析简单。
2.商品试剂与实验室自配试剂 我国的临床检验由完全的自配试剂进行日常检测∞进入到依赖商品试剂盒，是∮从上世纪80年代末Ψ 开始的，到90年♀代中后期，实验室基本不再使用〖自配试剂。分子诊断不同于临检、生化、一般免疫分析等，其日常检测◤量明显较少，且一些特定的检测项目如遗传病和罕见疾病的分子诊断，病例数更少，这些疾病的分子诊断试剂≡是永远也不可能有经过批准的商品试剂盒的，因此，就必须允许临床实验室◥自配试剂进行检测。最重要的是，如果是自配试♀剂必须有自配试剂的标〓准操作程序（SOP），包括↓从原材料选择及其每批质检、试剂配制、试剂的性能♀验证（重复性、准确性、特异性、检测下限、抗干扰能力等）、每批试剂质检方法等，最后形成的应是一个非商品试剂盒『，从内到外应有商品试剂盒所具备的所有必要成分，并标明有效期。实验室应保存该试剂制备的所有原Ψ材料购置、质检和制备的实验记录。用于日常检◥测时∞，应有严格的室内质量控制，如有室间质≡量评价，则应参加，如无，则∴应有实验室间比对，以保证日常检验的质量。
3.实验室检测的↘自动化 随着我国基础工业的进步及下游工业的全球化，临床分子诊断的自动化将逐步在国内的临床实验室应用。自动化首先⊙将是在目前手工操作且对结果影响最大的核酸提取上实现，然后是㊣结果的分析判断，这方面软件将起到最为关键的作用。当然最终目标【，是实现从核酸提取到↑扩增检测、结果报告全过程的☉自动化，国外一些》厂家如罗氏、凯杰已实现了这一点，但对于国内企业来说，仍需要一》个相当长的时间。
