一．无信号
1. 一抗与二抗不匹配
解决：一抗是】在哪个动物物种中生产的，二抗就要选择抗相应物种的（如一抗是用兔生产的，那么应选择抗兔的二抗）。
2. 和目标蛋白结合的一抗量不足
解决：提高一抗和二抗浓度。延长在4oC的孵育时间（如过夜）。
3. 抗体不适用于组织免疫化学试验，在组『织免疫化学试验中蛋白质保持天然的3维结构
解决：先用还原免疫蛋白印迹（注意：不是变性蛋白印迹）测试抗体是否可被天然结构的蛋白质识别。
4. 一抗/二抗/扩增试剂盒可∮能由于保存不当，错误的稀释或多次冻融而失去活性
解决：使用阳性对∮照确保一抗/二抗正常。
5. 研究的组织中不含目标蛋白
解决：使用【抗体供应商建议的阳性对照。
6. 目标蛋白在所研究的组织中表达的量少
解决：增加一步扩增来放大信号。
7. 二◣抗没有避光保存
解决：避免二抗见光。
8. 脱◥蜡不充分
解决：延长脱蜡时间，换用新的二∏甲苯。
9. 固定过程可能屏蔽了抗原决定部位
解决：用抗原修复技术使ぷ抗原暴露。缩短固定时间。不充分的固定造成样品边缘很强的染色，但样品中心无信号。
10. 目╳标蛋白位于细胞核内，以↑致抗体无法与之结合
解决：在洗涤液和/或抗体稀释液中加入透剂。可以用Tween 20作为透剂，但Triton X100更强。透剂的浓度由√切片的厚度决定。
11. PBS缓冲液被可破坏目标蛋白上的磷酸基团的细菌√污染
解决：在PBS抗体保存液中加入0.01%的叠氮或使用灭』菌不久的PBS。
12．曝光时间太短
解决：延长信号采集时的曝光时间。
二．背景过高
1. 没有封闭或封闭不完全♂
解决：延长孵育时间和/或提高封闭液中的血清浓度。更换封闭液。我们建议对切片用10%的正常血清★封闭1hr，对培养细胞用1-5%的BSA封闭30min。
2. 一抗浓度可能过高
解决：降低一抗浓度。
3. 孵■育温度过高
解决：在4oC孵育切片或细胞。
4. 二抗非▽特异性结合（抗体被破坏）
解决：使用一个◆无一抗的二级对照。
5. 固定剂残留
解决：在所有步骤之间〖用TBS或PBS充分洗涤。
6. 内源过氧▅化物酶有活性
解决：使用酶抑制剂（如使用2mM左旋咪唑抑制碱性磷酸〗酶，或0.3-3%体积比的过氧化氢々抑制过氧化物酶）。
7. 固定过程过强从而改变了抗体能识别的抗原识别部位㊣
解决：改变抗原修ω 复技术，减少与∑抗原修复液（antigen unmasking solution）的孵育时间。
8. 扩增过度
解决：减少扩增时孵育】的时间，并稀释扩增试剂盒。
9. （在用酶检测√时）使用了过多的底△物
解决：减少底物孵育时间。
10. （在用酶检测时）生色剂与组织或细胞中的PBS反应
解决：在与底◎物孵育前，用TBS缓冲液洗切片。然后在与底物◎孵育后用TBS缓冲液洗切片/细胞。
11. 透剂处理破坏了细胞膜并去除了膜蛋白
解决：不在缓冲液中⊙加透剂。
三．非特︾异性染色
1. 一抗/二抗浓度过高
解决：尝试降低抗体的浓度和/或孵育时间。与不表达目标蛋白的细胞的信号强度对照。
2. 内源性过氧化物酶有活性
解决：使用酶抑制剂（如用2mM左旋咪唑抑制碱性磷酸酶，或0.3-3%体积比的过氧化氢抑制过氧化物酶）。
3. 染色的组织来源于生产一抗的物种（如在小鼠组织上使用小鼠一々抗）。当使用二∞抗时，由于二抗是抗小鼠的，二抗◥与所有组织都结合。
解决：选择与所研究的组织来源不同的物种生产的抗体。
4. 切片/细胞干了
解决：将切片/细胞保存于高湿度中，不使其干燥。
