实验原理

根据噬菌斑数计算病毒滴度。

实验试剂

1. 4% agarose gel：2g agrose 50ml 水，高压灭菌

2. 2×Grace（unsupplemented）：9.14g粉末（invitrogen） 0.07gNaHCO₃ H₂O，调PH6.1，定容至100ml，无菌过滤

3. supplemented Grace：1×Grace添加3.33mg/ml Lactalbumin，3.33mg/ml yeastolate，无菌过滤

4. 高温灭活FBS

实验设备

1. 6孔板

2. 12ml离心管

3. 100ml无菌玻璃瓶

4. 无菌吸管

5. 70℃水浴锅

实验材料

杆状病毒， SF9：5×10⁵cells/ml

实验步骤

1. 无菌条件＠ 下，2ml/孔细胞（5×10⁵cells/ml）种入6孔板，室温孵育1h使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度；

2. 将4% agarose gel放入70℃水浴锅融∏解，空100ml无菌瓶与2×Grace放入40℃水浴锅预热；

3. 将杆状病毒用无血清supplemented Grace梯度稀释：10^-1~10^-8。
4. 弃6孔↘板内上清，快速加入稀释好的病毒，1ml/孔，复孔，室温孵育1h。

5. 配置上层琼脂：加20ml高温灭活FBS到2×Grace 100ml，25ml 2×Grace（含FBS） 12.5ml 无菌水 12.5ml 4% agarose gel，至预热的100ml无菌瓶，轻轻混匀，放入37℃水浴锅备用；

6. 弃6孔板内上清，快速加2ml上层琼脂，以防菌层干燥，静置10-20min使其凝固；

7. 将6孔板放入27℃培养箱，培养4－10天；

8. 计数板∏中噬菌斑，直至连续两天无变化，加1mg/ml中性红0.5ml，室温孵育2h后计数噬菌斑。

注：

病毒滴度（pfu/ml）=1/稀释倍数×噬菌斑数×1/每孔接种体积