鸡肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA检测试剂盒检测原理　　　试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往◣预先包被鸡肿瘤坏死因子α（TNF-α）捕获抗原的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测︽抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催①化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的鸡肿瘤坏死因子α（TNF-α）呈正相关。用酶标〓仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。样品收集、处理及保存方法1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收▲集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟◣取上清。3. 细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。5. 保存：如果样本收集后不※及时检测↑，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融△，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。自备物品酶标仪（450nm）高精度加ㄨ样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL37℃恒温箱操作注〒意事项 试剂盒保存在2-8℃，使用前】室温平衡∞20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。 实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。 预处理后的样本无需稀释，直接取10μL加样即可。 严格按照说明书中卐标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。 所有液体组分使用前充分摇匀。试剂盒组成名称 96孔配置 48孔配置 备注微孔酶标板 12孔×8条 12孔×4条 无标准品（300 ng/ml） 0.5mL 0.5mL 按说明书进行稀释标准品稀释液 6mL 3mL 按说明书进行稀释样本稀释∑　液 6mL 3mL 按说明书进行稀释检测抗体-HRP 6mL 3mL 无20×洗涤↑缓冲液 20mL 20mL 按说明书进行稀释底物A 6mL 3mL 无底物B 6mL 3mL 无终止液 6mL 3mL 无封板膜 2张 2张 无说明书 1份 1份 无自封袋 1个 1个 无注：标准品用标准品稀释↑液依次稀释为：300、150、75、37.5、18.7、0ng/ml.试剂的准备 20×洗涤缓冲液█的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的⌒蒸馏水。洗板方法 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上①拍干，如此洗板5次。 自动洗板√机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。操作步骤 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板∑　条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。 设置标准品孔、样本孔和空白孔，空白孔什么都不加；标准品孔各加不同浓度的标准品50μL； 待测样本孔先加待测↓样本10μL，再加样本稀释液40μL； 随后标准品孔和样本⊙孔中（空白孔不加）加入辣根过氧化物□酶（HRP）标记☆的检测抗体50μL，，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。 弃去液体，吸水¤纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤ㄨ液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可♀用洗板机洗板）。 所有孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。 所有孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。结果判断 绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度◣作横坐标，对应OD值Ψ作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。试剂盒性◥能 准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。 灵敏度：最低检测浓度小于1.0 ng/ml。 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。 重复性：板内、板间变异系数均小于15%。 贮藏：2-8℃，避光防潮保【存。 有效期：6个月 检测范围：9.3ng/ml-300ng/ml 免责声明 试剂盒仅供研究使用，不得〗用于临床实验或鸡体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。 严格按照说明书∩操作，不同批号不可交换使用，实验㊣者违反说明书操作，后果由实验者承担。