通路表达改变
肾小球硬化的主要发病机制之一是细胞外基质(ECM)的异常沉积。转化生长因子p1(TGF-B1)在ECM沉积中起作用,并与MAPK信号通路有密切▅关系。醛糖还原酶(AR)是多元醇代谢通路中的限速酶,研究证实AR基因为大鼠肾小球肾炎及肾脏硬化过程中系膜细胞(MsC)的TGF-6l反应性基因之一。以蛋白质印迹检测正常MsC、AR转基因MsC、应用醛糖还原酶抑制剂索比尼尔(sorbinil)和哇泊司他(zop01restat)分别孵育的MsC在TGF-p1刺激前后MAPK/磷酸化MAPK表达的变化。
1.方法
(1)培养细胞㊣ 后提取细胞总蛋白。
(2)配置10%分离胶和5%堆积胶,进行SDS-PAGE变性电泳。
(3)转膜后,以5%脱脂奶粉封闭,2~3h。
(4)加一抗:兔抗ERK/磷酸化ERK抗体、兔抗JNK/磷酸化JNK抗体、兔抗P38/磷酸化P38抗体(均为1:800),2~3h。
(5)TTBS洗膜,5minX 3次。
(6)加二抗:HRP标记的羊抗兔IgG(1:1 000),1h。
(7)TTBS洗膜,5minX 3次,
(8)DAB显色。
2.结果
正常MsC组(泳道1,A-C)和空载转染组(泳道2,A~C),丁GF-F1作用后能激活MAPK信号通路。AR活性被抑制或AR过表达对TGF-F1诱导的ERK的激活无作用(A)。AR活性被抑制后能显著降低JNK的磷酸化,抑制JNK活性,而AR过表达则能增强JNK的活性(B)。同样AR活性被抑制后能显著降低P38的激活,但AR过表达对P38的激活无作用(C)。
蛋白质印迹检测TGF-p1刺激前后AR对MsC内MAPK信号通路的影响
注:泳道1为正常Mst组;泳道2为MsC空载转染组;泳道3为索比尼尔作用于正常MsC组;泳道4为哇泊司他作用于正常MsC组;泳道5为AR转染MsC组
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