一、 试剂盒说明
在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴@ 露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素(EGFP、FITC)标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发ω生。
碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
本试剂盒可应用于培ω 养细胞凋亡检测(不推荐用于检测组织样本)。
二、 试剂盒组份
组份 |
Cat: KGA105 (10 assays) |
Cat: KGA106 (20 assays) |
Cat: KGA107 (50 assays) |
Cat: KGA108 (100 assays) |
储存条件 |
AnnexinV-FITC |
50μL |
100μL |
250μL |
500μL |
4℃避光 |
Propidium Iodide |
50μL |
100μL |
250μL |
500μL |
4℃避光 |
Binding Buffer |
5 mL |
10.0 mL |
25 mL |
50 mL |
4℃ |
三、 试剂盒以外自备仪器和试剂
流式细胞仪或卐荧光显微镜、低速离心机、微量移♀液器
1.5m L Microtube、载玻片、盖玻片(荧光显微镜观察需用)、PBS、不含EDTA的胰酶消化液
四、 使用注意事项
1. 微量试◥剂取用前请离心集液。
2. Annexin V-FITC,Propidium Iodide (PI)避光保存及使用。
3. Propidium Iodide (PI)有毒,操作时要戴手套。
4. 本试剂盒适用于检测活细胞,流式细胞仪检测时,细胞数量不以应低卐于1×105,,不推荐用于检测组织样本。
5. 推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞,需用不含EDTA的胰酶消化,如消化不ㄨ当,可能引起假阳█性,而用细胞刮子会造成细胞粘连成团,而影响检▓测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBS中,防止进一步的损伤。
6. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭,请不要固定样品。
7. 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种≡类、使用的检测仪器不同,因而流式检测的荧光补偿也不同,因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照,进行荧光补偿的调节。
五、 操作方法
1. 悬〗浮细胞离心(2000rpm离心5min)收集;贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集(注:胰酶消化时间不易过长,否则容易引起假阳性);
2. 用PBS洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)收集1~5×105细胞;
3. 加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞;
4. 加入5μL Annexin V-FITC混匀后,加入5 μL Propidium Iodide,混匀;
5. 室温、避光、反应5~15min;
6. 请在1 hour内,进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的@ 观察和检测。
A. 荧光显微镜观察
1. 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上,并用盖玻片盖上细胞;
2. 对于ξ贴壁细胞来说,也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡;
(1) 将细胞于盖玻片上生长,用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡,并设立阴性对照组;
(2) 用PBS洗涤细胞两次;
(3) 在500μL 的Binding Buffer中加入5μL Annexin V-FITC, 5 μL Propidium Iodide,混匀;
(4) 将上述溶液滴◥加于盖玻片表面,使盖玻片表面均匀覆盖;
(5) 避光、室温反应5 min。
3. 将盖玻片倒置于载玻片上,于荧光〇显微镜下、双色■滤光片(FITC和罗丹明)观察
Annexin V-FITC荧光信号呈绿色,PI荧光信号呈红色。
B. 流式细胞仪分析
用流式细胞仪检测,激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。
Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测;PI红色▂荧光通过PI通道(FL2或FL3)检测,建议使用FL3。
荧光补偿调节:使用未经凋∑亡诱导处理的正常细胞,作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位▲置。
六、 实验范例
用凋亡诱导剂诱导P388细胞凋亡,在37oC,5%CO2培养箱培养4~6h后,参照说明书的操作方法进行检测,经流式细胞仪检测结果见下图。