目前，大部分的细胞检测方法采用的仍然是传统的终点法——仅仅给出最终结果，而且往往需要标记细胞和破坏细胞。这种方法无法得到细胞在生长时的真正状态，也无法对细胞的生长过程做出动态的监测和分析。美国Essen公司开发了第二代长时间实时动态活细胞成像分析仪——IncuCyteZoom，用一种非侵入式的方法，记录细胞的实时生长状态。这种成像方法，被称为“实时细胞内涵成像”（Live ContentImaging），扩充了用户记录和理解细∑ 胞生长、细胞行为和细胞形态的途径。
与第一代成像仪IncuCyte FLR相比，IncuCyte Zoom是全新设计的，增加了很多关键的性能，包括支持多通道荧光成像，支持多物镜々选择，增加了形态处理的能力和达到更高的速度。新增的特【性有※：1）IncuCyte Zoom可支持高清晰度（HD）相差、黄绿荧光和↓红色荧光自动成像功能，图像处理软件支持对三通道成像的整合处理；2）用户可在1分钟之内自行更换4×、10×和20×物镜，而无须专业人员的帮助ぷ；3）因为拥有12个全核处理▲器和新的软硬件，其成像速度达到了第一代FLR的两倍；4）采用了新的相机设计，使其更适合长时间观察；5）设计了新的数据库，使用户能」更方便的查找和检索实验数据；6）增加了数据的存储量，配备了9TB的存储空间〓，并支持外部数据☉存储系统；7）提高了空气流速，改善了散热性能，增加了扫描时间；8）增加了系统监控，整合了湿度传感器、加速计来监测不可接受的震动、风扇速度和内部温度；9）用户可用位于控制机前部的LCD控制面板方便地检测和运行基础状态检查和操作。
图2：IncuCyte内部结构，支持超过200种标■准培养容器，可同时观察多达6块培养容器
图3：IncuCyte记录的细胞的相差图像和增殖曲线
图3是IncuCyte记录的细※胞增殖的相差图像和增殖曲线。左侧图像是在同一视野内间隔12小时拍摄的CHO细胞的相差图像，图像可以24小时连续生︼成，而无需将细胞移出培养箱。右侧的增殖曲线是依据ω间隔3小时的图像生成的，由软件自动将图像数◇据转换成定量的饱和度vs.时间的数据⌒，生成动态的增殖曲线。最后图像■会被导出成单独的JPEG文件或视频。
IncuCyte软件功能：用户可以在任何一台联网的计算机上操控仪器，而无需反复拿进拿出标本及出入细胞房，这使IncuCyte成为了一个“虚拟的培养箱”。IncuCyte最好的特点之一就是直觉式的软件界面设计。用户可以︼在软件的操作界面上定义耗材的类∩型、拍摄的□ 时间ω、位置及视野个数。支持在长时间拍摄过程中插入其他拍摄任⌒务继续进行拍摄，以充分利用仪器。IncuCyte可以〗自动对焦，自动进行图像收集。对得到的图像也可以进行亮度、尺寸、对比度的显示控制。用户可以自定◢义样本信息，进行分组分析，并可以电子◆化标记器皿，设定关键词，必要时Ψ 可用设定的关键词搜索数据库，方便查询过去任何时★间得到的图像和数据。用户还可以直接从软件中抓取图像、图表、曲线至Word、Excel、Powerpoint和Email中。生成的所有数据均可存□ 档，并且数据和图表可以打包封存，便于用户带回家分析。IncuCyte Zoom的新特性包括多荧光图像处理模块和新的相差成像处理模块。Zoom还设计了新的数据库，使用户能更容易查找和检索实验数据。
图4：软件操作界▅面
IncuCyte的应用：
（一） 监测细▅胞增殖（Proliferation）
可监测细胞→的饱和度，或用荧光标定细胞核，计算细胞核的个数。
关键特性：1）IncuCyte Zoom结合NucLight Red和NucLight Green试剂，直接监测细胞增殖；2）在4×、10×或20×物镜条件下对细胞核进行实时计数；3）每个时间点可提◎供576个（96孔板）和2304个（384孔板）孔的数据；4）自动进行图像获取和处理；5）可计算基于细胞核计数的倍增时间，而无须lift细胞；6）可得到生长因子对原生细胞（primary cells）和→长生细胞（immortalized cells）增殖的影响；7）细胞不离开培养『箱，所有数据均有图像和影片验证。
图5：转染NucLight Red lentivirus试剂的HT-1080细胞用不同浓度的Cycloheximide，CHX处理，在4×条件下用Zoom每3小时拍摄一次。虽然没有观察到】细胞形态的变化，但观察到基于浓度的细胞增殖的抑制。曲线下面积（AUC）值被用于计算化合物的IC50值。倍增时间通过计算指数生长公式得到。下方的图像为48hr时的荧光图像。
图6：HUVEC细胞用NucLight Red lentivirus试剂转染，血清饥饿2hr后用含1%FBS和不同→浓度bFGF的基础培养基培Ψ养（左图），或bFGF保持在10ng/ml，而Suramin的浓度不断增大（右图）。用Zoom每3hr拍摄一次，左图用4×物镜拍摄，而右图用10×物镜拍摄。整个实验进程中都进行了细胞核计数，并通过计算曲线下面积（AUC）获得EC50和IC50值。
（二）细胞质控（Cell Culture QC）/细胞培养优化（Cell Culture Optimization）
监测细胞形态上的变化，对细胞◥培养进行质控，如进行自动化的细胞培养，用175T培养瓶，培养出大量且高质量的细胞，可做进一步细胞分析实验的细胞来源。监测生长曲线与培养基的↙血清浓度的变化，寻找最适合的培养基的血清浓度。监测生长曲线与▼培养基的配方的变化，寻找最适合的培养基配方。
关键特性：1）对高清晰相差成像进行用户定义的相分割；2）可收集到4×、10×或20×的图像；3）非标记的相分割指标利用细【胞饱和度跟踪细胞随时间的生长状况；4）能够█检测促血管生成（pro-angiogenic）和抗血管生成（anti-angiogenic）的反应；5）可对克隆进行计数和大小观察；6）可通过对培养瓶不同部位的成像，优化细胞的分布；7）可对图像和数据进行存档，以便在未来对生长特性进行回顾确认；8）根据细胞饱和度，优化原生细胞和长生细胞的︽生长条件；9）可决定最佳」接种密度；10）可分析微孔板▼布局，促进移㊣液技术。
图7：HUVEC细胞培养在包含生长因子和不同浓度胎牛血清（FBS）的培养基≡中，HUVEC的最佳FBS浓度是＞2.5%。
图8：对不同接种密度的HT-1080细胞每3小时拍摄一次，一共拍摄3天，得到实时◣动态的饱和度vs.时间的图像。
（三） 监◣测细胞毒性（Cytotoxicity）
细胞毒性发生时，细胞膜会破¤裂，这时使用非■渗透的染料YOYO-1就可以将发生细胞毒性的细胞染色，然后用IncuCyte进行观察。
关键特性：1）运用NucLight试剂，并结合细胞非渗∮透性DNA染料；2）可区别细胞毒性（Cytotoxic）和细胞抑制（Cytostatic）；3）可从双色分析仪中输出数据，计算EC50和IC50；4）可通过获取4×、10×或20×的高清晰度相差图像，跟踪细胞形态，确认细胞是否☆死亡；5）可保存和重新使用过程定义，为ω未来的实验分析YOYO-1和NucLight-Red数据。
图9： HT-1080细胞用NucLight-Red标记，并在YOYO-1存╳在的条件下用喜树碱（Camptothecin）处理。高清晰度相差图像和荧光图像用于确认细胞是否死亡。
图10：用基础◢分析仪（Basic Analyzer）计算红色细胞核的个数和YOYO-1标记的细胞随时间的变化。数据输出后，曲线下面积（AUC）被用来计算喜树碱（Camptothecin）对HT-1080细胞作用∩的IC50值和EC50值。
图11：喜树碱（Camptothecin）（上图）和Cycloheximide（下图）引起的HT-1080细胞的毒性（Cytotoxic Effects）和□ 抑制作用（Cytotostatic Effects）。左图表示用YOYO-1动态╳显示的细胞的死亡，右图表示用NucLight Red显示的细胞的增殖。
（四） 监测细胞凋亡（Apoptosis）
CellPlayer细胞凋亡试剂盒中的凋亡试剂是DNA染料和Caspase3/7酶的底物的连接物。如果细胞发生Caspase3/7途径的凋亡，当将此试剂加入培养基时№，细胞膜上的活化的Caspase 3/7酶就会降解此连接物√，使原来不发光的染料从★连接物中脱离下来，与细胞的DNA双链结合，从而发出黄绿荧光，被IncuCyte检测到。这样就ω 可以用IncuCyte观察细胞的凋亡全过程。
关键特性：1）用NucLight试♂剂标记细胞来检测细胞的增殖，并动态监控化合物的细胞抑制（抗增殖）作用；2）直接向细胞中加入Caspase 3/7试剂，而无需额外的洗涤步骤，可检测由内↑在或外在途径引起的细胞凋亡；3）可从双色分析仪中输出数据，计算IC50和EC50。4）用4×、10×或20×物镜观察高清晰度相差图像，以确定细胞的死亡；5）定量的可重复性：可保存并重新使用过程定义，方便未来实验时分析Caspase 3/7和NucLight Red数据；可进行96孔和384孔形式的★实验；每次可观察6块微孔板。
内在通路（Intrinsic Pathway）引起的细胞凋亡：
图12：表现为红色细胞核的宫颈腺癌细胞在有Caspase 3/7试剂的条件下用不同浓度的十字孢碱（Staurosporine，SSP）处理。过程定义可以准确计量红色细胞核对象个数和绿色Caspase 3/7对象个数。
图13：通过基『础分析仪输出Caspase对象个数/mm2和细胞核对▽象个数/mm2，并利用∑曲线下面积（AUC）计算出EC50和IC50。
图14：用基础分析仪，可检测随时间改变的Caspase 3/7活性（左图）和细胞核个数（右图）。
图15：外在通路引起的细胞凋亡。在5µg/mlCycloheximide存在的条件下用不同浓度的肿瘤坏死因子α（TNF-α）处理A549肺上皮细胞（Lung Epithelial Cells），用基础分析仪定量计∑ 算Caspase 3/7的活性。
图16：左图是HT-1080细胞在8mg/ml Matrigel中的细胞侵＠袭图像；右图是MDA-MB-231细胞在6mg/ml Matrigel中的细ξ 胞侵袭图像。
图17：左图是三种细胞系，HT-1080、MDA-MB-231和MCF-7的细胞迁移曲线；左图是两种细胞系，HT-1080和MDA-MB-231的细♀胞侵袭曲线，MCF-7细胞不发生细胞侵袭。
图18：药理学研究：显示◥肌球蛋白抑制剂（blebbistatin）对HT-1080细胞在8mg/ml Matrigel中的细胞侵袭的浓度响应。
（六）监测血管新生（Angiogenesis）
血管新生是◣一种复杂、多步的过程，包括内皮细胞增殖、内皮细胞迁移和血管形『成。IncuCyte的CellPlayer Angiogenesis PrimeKit将GFP标记的人脐带血管内皮细胞（human vascular endothelial cells，HUVECs）和正常的人真皮成纤维细胞（normal human dermal fibroblast，NHDFs）共培养，共培养物就会有新生血管生成，然后用IncuCyte进行观察。IncuCyte Zoom和CellPlayer Angiogenesis PrimeKit合用，能监测血管生成的全》过程，同时测←定药物对血管生成的作用。
关键▓特性包括：1）使用人类的原生细胞和共培养体系显示血管新生过程中的所有阶√段的变化；2）有活细胞和冷冻细胞试剂盒两种选择；3）Zoom和血管◥新生软件相结合可自动获取时序性图像，提供血管¤长度、血管面积和分支节点个数等动态指标；4）动态读数可研究复杂的通路，包括VEGF（血管内皮生长因子）和non-VEGF（非血管内皮生长因子）信号介导的血管新生和血管分解；5）能测量促血管生成（pro-angiogenic）和抗血管生成（anti-angiogenic）的作用；6）所有数据均有图像和影片进行验证；7）可在96孔微孔板》中反应，数据定量并可重复。
Essen可提供CellPlayer血管新√生原生冷冻试剂盒（CellPlayer Angiogenesis PrimeKit -Cryo）、CellPlayer血管新生原生新鲜试★剂盒（CellPlayer Angiogenesis PrimeKit-Live），和血↘管新生实验外包服务。具体试剂盒规格和实验外包▼服务可参考Essen网站。
图19：血管新生，第1天和第14天对比，血管长度从0.6mm/mm2增长到11.6mm/mm2
图20：不同浓度的血管内皮生长因子（VEGF）对血管新生的动态作用。
另一种试剂盒是CellPlayer Angiogenesis StemKit，它将用GFP标记⌒ 的内皮克隆形成细胞（endothelial colony-forming cells，EDFC）和脂肪组织来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSC）共培养，共培养物就会有新生血管生成，然后用IncuCyte进行观察。IncuCyte Zoom和CellPlayer Angiogenesis StemKit合用，能监测血管生▃成的全过程，同时测定药物对血管生成的作用。
关键特性包括：1）是人类来源的共培养干细胞模型；2）以冷冻试剂盒形式提供；3）比PrimeKit试剂盒的血管生成速度更快；4）外皮细胞生物学（Pericyte biology）；5）可对血管形成和血管分解进行动态读取；6）所有指标均有图像和录像进行验证；7）可在96孔微孔板〗上进行实验，重复性好（Z’＞0.8）。
Essen可提供冷冻形式的CellPlayer血管新生干细胞试剂盒（CellPlayer Angiogenesis StemKit）和血管新生实验外包服务。具体试剂盒规格和实验外包服务可参考Essen网站。
图21：将促血管新生蛋白▃因子（angiopoietin 2，Ang-2）加入已形成∞的血管网络中，动态数据显示血管发生分解。
（七） 监测√报告基因（Reporter Gene）
细胞用含GFP的载体转染，GFP的上游插入需要研究的启动子。这样就可以通过IncuCyte观察GFP的荧光强度和发出荧光的细胞数目，从而监测启动子〗的活性或报告基因的表达活性。
与传统的终点荧光素酶方法对比，IncuCyte的关键ξ特征在于：1）数据丰富：96孔的实时动态数据可获得终点法无法获得的洞察㊣能力；2）节约成本：无需裂解，无需荧光素酶法需要的终端反应底物，节省时间和花费；3）方便：实时动态读数使用户能在单个的实验中优化信号窗，无需事先决定何时终止实验；4）敏感：可得到每个条件☆下的多个时间点数据，增加了实验的定量性和稳定性（quantitative robustness）；5）可定制：用户可根据需要定制启动子，修改反应体『系，监测药物对报告基因的作用。
Essen可按照客户需要】提供此实验的外包服务，具体外包服务内容请参考Essen网站。
图22：rhTNF-α刺激诱导◇的HEK293细胞中，rhGFP报告基因表达的NF-κB的活性。在用pNF-κB-rhGFP报告基因转染的HEK293细胞中，用3倍稀释的rhTNF-α处理。图像以15min为间隔获得。图像表示外在的rhTNF-α的浓度越高，细胞内部的NF-κB的ぷ活性越强,细胞的荧光饱和度就越大。对象荧光饱和度表示报告基因的表达活性和/或启动子的活性。
（八） 神经生长※跟踪（Kinetic NeuroTrack）
IncuCyte Zoom可定量分析神⊙经元的神经突的生长状况，得到图像和生长曲线。
关键特性包括：1）对神经突的动态生长（如初始状态、分支、延伸、回缩）进行非标记的实时动态的定量分析；2）自动的图像获取和整合的分析软件方便进行准确々的神经突检测和数据分析；3）具有多重实验〓能力，可用IncuCyte Zoom平行监控高清晰相差成像和多通道荧光成像；4）与多种神经元细胞类型（包∩括细胞系和原始细胞）相兼容。
图23：96孔微孔板中︽的鼠E18皮层神经元的神←经突生长。A）接种96小时后，原始神经元的20倍相差图像；B）对神经突（黄色）和细胞群（紫红色）进行图像分割处理；C）神经突在不同浓度的蛋白激酶C抑制剂Ro-31-8220的作用下的随时间的抑制作用（mean±SD，每个条件下n=6）
图24：96孔微孔◣板中的iPSC衍生的iCell神经元的神经突生长。左图：不同接种密「度下的iCell神经元的神经突随时间的生长（mean±SD，每个条件下n=6）。右图：96小时时接种量为10k细胞/孔的iCell神经元细胞的20倍相差图像。
图25：96孔微孔板中神经元-2a NucLight Red细胞的神经突生长。左图：用16µM全反式维甲酸（all-trans retinoic acid）处理78小时后的20倍的相差成←像和红色荧光成像的混合图像。右图：处理78小时后的随全反式维甲酸浓度增╲加而改变的神经突长度，该神经突长度已对细胞◣个数进行了标准化（mean±SD，n=10）。
IncuCyte Zoom的应用总结：
1）监测细胞增殖（Proliferation）：通①过实时动态成像，对细胞增殖进行非侵入性的、定量的分析；
2）细胞培养质控（Cell Culture QC）/细胞培养优化（Cell Culture Optimization）：通过实时动态成像，可生成基于细胞饱和度的动态生长曲线；
3）监测细胞毒性（Cytotoxicity）：将染料和ㄨ细胞混合然后读数，操作者可离开，是基于染料的→实验╲；
4）监测细胞凋亡（Apoptosis）：将凋亡试剂↘和细胞混合然后读数，操作者可离开，是基于染料的实验；
5）监测细胞迁移（Cell Migration）/细胞侵袭（Cell Invasion）：配套高度一致性的96孔伤口划痕工具，实时动态监测伤口的愈合过程，可得到细胞运动的定量指标；
6）监测血管新生（Angiogenesis）：使用通过验证的血管新生试〒剂盒，具有动态分析血管新生的定量指标；
7）监测报告基因（Reporter Gene）：细胞无需裂解，可获得实时动态数据→；
8）神经生长跟踪（Kinetic NeuroTrack）：可定量分析神经元细胞的神经突的生长状况。
总结：
以上一些关键的重要的应用介绍，展示了IncuCyte Zoom 系统在定量的、非入侵性的、实时细胞分析上的作用。非标记、非损伤性的成像技术以及数据分析可以让用户获得高质量的图像、录像和数据●。与其他利用电子阻抗监测细胞不同，IncuCyte可以记录细卐胞形态，得到图像和动态的录像。另外，Essen还开发出更多的活细胞实时动态观察试剂盒（live cell kinetic assays and reagents），与Zoom配套使用，进行实验开发●（assay development）、技术评估（technology assessment）、外包服务（fee-for-service outsourcing）和药物开发合作（drug discovery partnerships）。
订购信息：IncuCyte Zoom分HD和2CLR两款，HD只能做相差成像，而2CLR可以做相差和红/绿双色荧光成像，并且HD可以升级到2CLR。套件包括：细胞迁移/侵袭套件（包括分析软件、96孔划痕器Wound Maker和15块96孔ImageLock微孔板）、神经跟踪套件（包括分析软件）和血管新生套件（包括分析软件）。
