病毒构建包

重组腺病毒-慢病毒构建包装服务
为促进国装
内相关领域的研究进展，RealGene从2008年开始，对国内实验室开展重组腺病毒/慢病毒构建、包装及扩增服务，可以由客户提供自己的
基因，完成腺病毒/慢病毒构建、鉴定、包装的服务。
一、技术路线：
（一）A、腺病毒载体构建：
本系统是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA为骨架，在克隆、包装、扩增等各部条件做了改进和优化，达到了克隆阳性率更高、质量◥更可靠、
包装稳定、出毒迅速、滴度高等效果。在此基础上，还拓展了更广泛的应︼用，可以提供各种带报告基因的，带不同标签的腺病毒构建和包装服务。
所包装的腺病毒已成功应用于信号转导，基因转位，Co-IP，动物实验，干细胞研究等科研实验。并且可以完成较高难度的克隆构建，包括具有
细胞毒性作用基因的∩腺病毒构建，在短时间内完成从原始质粒到病毒DNA的构建工作。
? 克隆目的基因◢到穿梭载体（中介载体）及鉴定
根据客户提供的原始质粒信息确定克隆方案：
o 如果原始ζ质粒与本系统所用穿梭载体有匹配酶切位点，采用→相应的内切酶切下相应片断，回收并连接到穿梭载体。酶切，测序鉴定；
o 如果原始质粒与本系统所用穿梭载体没有匹配酶切位点，设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增，得到目的片断，采用相应的内
切酶切下相应片断，回收并连接到穿梭载体。酶切，测序鉴定；
o 对于不适用于以上方案或者∏有特定要求的样品，与客户协商定制具体实施方案
2）克隆目的基因到腺病毒载体pAdPL及鉴定
利用重组技术将目的片段的表达框从穿梭载体转移到腺病毒载体。
酶切鉴定↙阳性克隆，将阳性克隆测序二次鉴定。
B、慢病毒载体构建
慢病毒（Lent virus）载体是以HIV-1（人类免∑疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体，该载体可以将外」源基因有效地整合到宿主染色体
上，达到持久性表达的效果。可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细㊣　胞等多种类型的细胞，效果非常理想，
因此具有广阔的应用前景。
（二）病毒包装、扩增：
? 将鉴定正确的基因克隆到慢病毒载体，与辅助载体一起↓转染293T细胞进行包装；
? 将包装好的病毒超速离心收集；
? 将浓缩病毒进行滴定，滴定结果单位为PFU/ml（一般为5×108 PFU/ml以上，体积为500μl以上，根据客户需①要，不同量有价格差异）
二、质量控制与鉴定：
? 测序鉴定
? 根据特定引物作RT-PCR鉴定
? 蛋白表☉达鉴定（根据客户要求并由客户◆提供高特异性抗体）
三、客户须知：
对于客户所要构建腺病毒的目的基因，客户须提供详细的基因相关信息，包括基因序列，载体序列，载体图谱。
载体构建步骤所需时间，根据不同构建方案，需15到25个工作日。
从合同签订之日起，客户需交纳首期技术服务费（50%服务费），方可进行实验〖。服务结束时一次结清余款。
客户需提供的信息及材料：
? 插入目的片段序列信息，原始载体序列信息，载体图谱，酶切分析图等。
? 鉴定正确的原始质粒，PCR引物及PCR鉴定方法说明（包括PCR体系及PCR条件）（非必需，或需协商），测序引物（非必需，或需协
商）。
? 原始质粒的酶切鉴定报告、测序报告，如果客户确定基因的信息无误，这条非必需。
? 实验目的、要求，目的基因有无细胞毒性，是否需要构建对照病毒？
? 实验要求包括：是否自行构建腺病毒载体？是否要求更换启动子、polyA等基因元件？
? 实验目的包括：用于细ω　胞实验还是动物实验，需要感染的细胞类型或动物模型类型。
四、我们】的承诺：
? 构建腺病毒/慢病毒载体的时间约15到25个工作日。病毒的包装，扩增ぷ的时间约20到30个工作日。总计需要45-55个工作日。
? 提供重组穿梭载体或者siRNA载体，重组腺病毒载体的酶切及测序报告。
? 免费提供一管阴性对照（仅限通用型的，如果客户指定的序√列，需要另外计费）。
? 最大插入片段5kb－8Kb。
补充说明：
? 如果客户需更换启动子，需保证所插入的基◤因的表达产物对细胞无毒害作用，
? 如果插入的目的片段太长，客户要求测序验证全长，需要提供基因的特异引物，以测得■全长，加收一定的费用。
五、腺病毒和慢病毒比较表

腺病毒载体系统和慢病毒载体系统比较
病毒表达系统 腺病毒表达系统（Adenovirus） 慢病毒表达系统（Lentivirus）
病毒基因组 双链DNA病毒 RNA病毒
复制 自主复制 自主复制
是否整合 病□　毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时△表达外源基因 病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因

感染细胞类型 感染分裂和不分裂◎细胞 感染分裂和不分裂细胞，适合难转染的原代细胞（如神经细胞，淋巴细胞）及体内¤实验
表达丰度 高水平表＠达 中水平表达
表达时间 快（1-2 天） 慢 ( 1-3天 )
滴度 滴度高达1011pfu/ml 滴度最高可达108 pfU/ml
克隆容量 可插入高达8kb的外々源片段，滴█度随插入片段长度增加而降低 可插入不超过8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低
免疫原性 高免疫原性 低免♀疫原性