实时荧光定量PCR（Real Time-PCR）

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基〗团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

1.在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念—— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反ㄨ应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

2.荧光域值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
3. Ct值与起始模板的关系
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准』曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得『未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
4.荧光化学　　
荧光定量PCR所使︼用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：
(1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核◢苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光∏信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光◆分子形成，实现了荧光信号的累积↙与PCR产物形成完全同步。
(2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射▲荧光信号，而不掺入㊣　链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保↓证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

拜沃生物荧光定量PCR/RT-PCR实验流程:
1. 根据基因∮序列设计特异性的引物和荧光探针。
2. 提取 DNA/ RNA 。
3. Real Time PCR荧光定量PCR，进行实验结果分析
4. 本公司提供完整的实验◥报告（含软件分析结果）及引物等◥实验资料。
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