鸡 (学名：Gallus gallus domesticus) 是最常见的家禽之一，是全球肉类和蛋白质的重要来源。鸡体型小、易繁殖、孵化期短 (仅 21 天)，性状优良的蛋鸡甚至在一年中的 316 天都在产蛋。根据国家统计局的数据显示，2021 年全国白羽肉鸡出栏量有 65.32 亿只，蛋鸡存栏量有 10.50 亿只。可见鸡对人类的饮食结构有着不可替代的作用。
图 1. 刚出雏两天的鸡宝宝；图 2. 用保鲜膜壳外培养的鸡胚
除了吃以¤外，鸡对脊椎动物的发育生物学、免疫学、生理学等研究领域也有不小的贡献。
鸡是⌒第一个进行基因组测序的家禽，基因组大小＠为 1.06 G，是人类的三分之一，但与人类基因组的同源性高达 60%。这也是为什么禽流感会成为人兽共患病的原因。
鸡胚的整个发育过程都在体外 (蛋壳中) 进行，可以直观地观察到每一个发育过程。因此，鸡胚也一直被用作模式生物来研究Ψ 发育中的胚胎。除此之外，鸡蛋还可作为生物反应器，进行基因编辑后可以让母鸡产下的蛋中含有难以体外合成的药用蛋白。
如何对鸡进行基因编辑？
目前效率较高的鸡基因编辑方法主要有两种：PGC 编辑法和精子载体№法。
PGC 编辑法
原始生◥殖细胞 (PGCs) 是高度特化的细胞，起源于外胚层，最初位于 X 期胚胎透明区的中↓心位置。在孵化至 3-4.5 天时，PGC 迁移到生殖脊，随着性腺的发育，分化为雌性或雄性配子[1]。对 PGC 的编辑可从源头改变基因型，因此，它成为制备基因编辑鸡的理想选择。将编辑后的 PGCs 后注入受体∞胚胎产生嵌合体，培∮育至性成熟后，嵌合体之间再交配，就有概率能够从后代中获得基因编辑后的纯合体。Ioannidis 等人使用 PGC 编辑法在受精卵中敲除性别决定基因 DMRT1，获得 DMRT1 缺失个体，雄性 DMRT1 缺失个体表现出雌性性状，这直接证明了 DMRT1 剂量是鸟类的关键性别决定因素，对睾丸发育至关重㊣要[2]。
图 3. PGC 编辑法获得 DMRT1 突变体的过程[2]
将雄性 PGCs 编辑后注射到雄性受精卵中，由此获得缺失一个等位 DMRT1 的雄鸡 (ZD+ZD-)，性成熟后与野生型母鸡 (ZD+W) 交配，获得具有四种基因型的子代：野生型雌雄鸡 (ZD+ZD+、ZD+W) 和突变型雌雄鸡Ψ(ZD+ZD-、ZD-W)
精子载体法
精子载体法是将精子在体外进行基因编辑后递送到受≡体母鸡中，从而产生基因敲除后的后代。这一方法弥补了 PGC 细胞难以体外培养的不足。Cooper 等人使用精子转染辅助基因编辑的方法同样将 DMRT1 用 CRISPR/Cas9 系统敲除，编辑⊙效率为 0~26%[3]。
刚刚提到的 CRISPR/Cas9是近几年非常火爆的基㊣ 因编辑技术。
CRISPR 系统最早是由日本研究者石野良纯于 1987 年定义的。这个系统特异性地存在于大多数细菌和古生菌基因组中，能够抵抗噬菌体对细菌的破坏，被认为是细菌的适应性免疫系统[4]。目前广泛使用的 CRISPR/Cas9 基因编辑技ξ 术是由细菌的适应性免疫机制∩类型 II 改造的。Jinek 等人』通过融合 crRNA 和 tracrRNA 构造了一种更简单的引导 RNA——sgRNA (single guide RNA)[5]，通常只有 20 nt。这一创新的出现简化了 CRISPR/Cas9 技术的操作过程。sgRNA 能与靶序列互补配对，引导 Cas 蛋白对靶基因进行切割。因此，设计出一个特异性高的 sgRNA 是这项技术成功的关键因素之一。
图 4. 细菌的三种适应性免疫机制[4]
我们一起来看看 CRISPR/Cas9 在鸡上是如何应用的吧~
在哺乳动物中已证明肌生成抑制素基因 (MSTN) 在哺乳动物的肌肉生长中发挥重要的作用，破坏该基因能增强骨骼肌的形成，可能有利于肌肉性状的改良。Xu 等人利用 CRISPR/Cas9 系统在雏鸡中敲除 MSTN 基因，与对ζ照组相比，多数差异基因及 GO terms 与细胞增♀殖分化、肌肉生长发育、能量代谢等过程相关[6]。
禽流感病毒一直是危害人类健康及阻碍禽养殖业发展的敌人。研究表明，甲型流感病毒 (IAV) 能够通过≡鸡的 ANP32A 蛋白进行复制，用 CRISPR/Cas9 在鸡胚成纤维细胞 (DF-1) 中编辑 ANP32 基因，使之ω 缺乏完整的 ANP32A 后，感染病毒滴度与对照组相比显著降低[7]。这为抗禽流感品种的培育提供了新思路。
基因编辑还能使鸡成为生物反应器。Oishi 等人使用 CRISPR/Cas9 技术将 hIFN-β cDNA 引入 PGC，制备了基因编辑鸡，成功使编辑母鸡在其管状腺体中表达 hIFN-β，并在蛋清中产下含有大量 hIFN-β 的鸡蛋[8]。这一发现能为鸡蛋在生物制药生产中开辟▲新途径。
图 5. 敲入 hIFN-β cDNA 的基因编辑鸡产出的蛋清中含有 hIFN-β
a：野生型母鸡 (WT) 产下的鸡蛋；b：敲入 hIFN-β cDNA 的母鸡 (KI) 产下的鸡蛋，蛋清中有白色絮状物 (white cloud, Wc)；c：通过 SDS-PAGE 评估 KI 和 WT 母鸡▂蛋清中 hIFN-β 的产生。左 1 泳道为 WT蛋清，左 2 泳道为 KI 蛋清白色絮状物 (箭头为 hIFN-β 条带)，左 3 泳道为 KI 蛋㊣清透明部分
然而，与哺乳动【物相比，鸡的受精卵结构和产卵过程较复杂 (鸡蛋产出后就有已有 6 万多个细胞)，无法获得单个卵子，因此，基因编辑在鸡上的应用与发展不那么一帆风顺，目前依然存在」编辑效率较低、纯合々体制备周期长等局限。
鸡基因编辑之路，道阻且长，但是，编辑技术始终在发展中，相信在未来科研工作者们能够突破这些壁垒。
参考文献
1. B. C. Li, et al. Relationship between PGCs Settle and Gonad Development in the Early Chicken Embryo. Anim Biosci 2004;17(4):453-459.
2. Ioannidis J, et al. Primary sex determination in birds depends on DMRT1 dosage, but gonadal sex does not determine adult secondary sex characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Mar 9;118(10):e2020909118.
3. Cooper CA, et al. Generation of gene edited birds in one generation using sperm transfection assisted gene editing (STAGE). Transgenic Res. 2017 Jun;26(3):331-347.
4. Hsu PD, et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 2014 Jun 5;157(6):1262-1278.
5. Jinek M, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21.
6. Xu K, et al. Effective MSTN Gene Knockout by AdV-Delivered CRISPR/Cas9 in Postnatal Chick Leg Muscle. Int J Mol Sci. 2020 Apr 8;21(7):2584.
7. Long JS, et al. Species specific differences in use of ANP32 proteins by influenza A virus. Elife. 2019 Jun 4;8:e45066.
8. Oishi I, et al. Efficient production of human interferon beta in the white of eggs from ovalbumin gene-targeted hens. Sci Rep. 2018 Jul 5;8(1):10203.
