解析牛奶中β-内酰胺酶∏检测方法

　　“无抗奶”，顾名思义，即不含抗生素的︼牛奶。早在2002年，这一概念便Ψ被提出，“无抗生素”的字样也登上了乳品包装。

　　为何牛奶含抗生素？

　　牛奶中的抗生素来自乳牛，乳牛被注射抗生素，主要是治∮疗乳腺发炎。乳腺◥炎是奶牛常见病，抗生素的使用是业内“公开的秘密”。牛奶中的抗生素可能导致饮用者过敏，或因长期接触抗生素而耐药。

　　如何做到“无抗”？

　　药品合理间隔期后才挤奶，可以生产无抗奶，可以通过检☉验抗生素的方式验证。

　　1、间接法

　　方法原理：利用β-内酰胺酶能够酶解青霉素的原理〇，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中◆存在一定浓度的β-内酰胺酶，那么青霉素经β-内酰胺酶酶解后浓度会减少，从而判断牛奶中』是否存在β-内酰胺酶。

　　实验步骤：称取20 g试样，在4℃、16000rpm条件下№离心10 min。取下层清液10 g于50

　　mL塑料离心▃管，并将塑※料离心管置于37℃水浴锅中振荡孵育30 min。向孵育后的离心管中加入无水乙醇15 mL。振荡提取30

　　min后离心，将上层清液过滤纸后收集于梨形瓶中。减压浓缩蒸发掉乙醇。向旋蒸后▲的梨形瓶中加入10 mL磷酸盐缓冲液（pH=8.5），涡旋1

　　min后调节pH为8.5。以1 mL/min的速度将提取液通过经过预处理的Oasis HLB固相萃取柱，用2 mL磷酸缓冲液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用2

　　mL水淋洗。最后用3 mL乙腈洗脱。将洗脱液在40℃下氮』气吹干，用0.025 M磷酸盐缓冲液（pH=7.0）定容残∑　渣至1

　　mL,待上机测定。

　　色谱条件：LabAlliance

　　PC-2000高效◥液相色谱配500型紫外检测器；

　　lanbo色谱柱

　　:C18(4.6mm×150mm×5μm)；

　　流动相: 甲醇/0.004M

　　磷酸二氢∴钾（pH=4.5）＝40/60；

　　检测波长: 268 nm

　　2、直接法

　　方法原理：牛乳中∑的青霉素钾在β-内酰胺★酶的作用下▓，主要生成青霉噻唑酸钾，并伴随生成少量的青霉胺、青霉醛等物质。经去脂肪、蛋白等前处理后，可以将青霉噻唑酸钾提取出△来，经高效液相色谱仪检测确认其是否存∮在，从而判定该牛乳是否为人造“无抗奶”。

　　实验步骤：称取20 g试样，在4 ℃、16000 rpm条件〖下离心10 min。取下层清液10 g于50

　　mL塑料离心管，加入无水乙醇15 mL，振荡提取30 min后离心，取清液经0.45

　　μm的滤膜过滤，用高效液相色谱仪检测。

　　标准溶液配ζ　制：称取0.01 g（精确至0.001 g）青霉素〓钾于100

　　ml容量瓶中，加入1ml市售抗生素分解剂，室温放置2h使青霉素钾酶解完全后用去离子水定容，得到青霉噻唑酸钾标准溶液，浓度100

　　μg/mL。根据实际情况稀释后使用。

　　色谱条件：LabAlliance

　　PC-2000高效液相色谱配2000型紫外检测器；

　　lanbo色谱柱 :C18(4.6mm×150mm×5μm)；

　　流动相: 甲醇/0.004

　　M磷酸二氢钾（pH=4.5）＝40/60；

　　检测波长: 230 nm