制备○微生物检测培养基细节问题

　　一、称取

　　用精确度1/100的电子天平称取培养基所需药品。先根据配方计算出配制一定量培养基所需各种成分药品的量，然后用天平准确称取。称量时用称量纸折叠成簸箕状盛放药品。称量纸折叠方法如图所示。

　　二、溶化

　　培养基放入烧杯或搪︾瓷缸中，慢慢加入少量所需水，边加→入边用玻棒搅拌。如果培养基中不含有〗琼脂，培养基不需要加热;如果含有琼脂，则需要用本生灯或电磁炉加热煮沸，完全溶解后，再补齐所需水，并搅拌均□匀(如图3所示)。如果配制的¤培养基量很大，可用不锈钢锅加热溶化，可先用温水加热并随时搅动，防止焦化，如有焦化现象，配制的培养基就不能使用，要重新配制。

　　配制培养基时不可用铜或铁的容器溶化，因铜或铁制容◤器可能会使培养基中的铜和铁的含量超标，影响实验(培养基中∮铜含量大于0.3mg/L，细菌不■宜生长，铁含量超过0.14mg/L，妨碍细菌产毒素)。对容易发生反应，产生沉淀的药品，要分开溶解，最后加◣入培养基，如ω磷酸氢二钾和硫酸镁。

　　三、调pH

　　虽然培养基中含有缓冲物质成分，能使培养基的pH尽可能的保≡持在要求的范围内，但是配出的培养基若不符合要求，就要进行必要的调整。如果有已校准ぷpH计，可用pH计，如果没有，可用精密的№pH试纸，再根据需要用1 mol/L氢╳氧化钠或1mol/L盐酸(微调可用0.1氢氧化钠或0.1mol/L盐酸)调制所需的pH。培基的pH一般为7.4～7.6，也有酸性或碱性的。用氢氧化钠调整的需要高压灭菌的培养基，在调整pH时要调至高出所需0.1个～0.2个单位，因用氢氧化钠调整时，高压灭菌后，培养基的pH要降低0.1~0.2。如培养基中含有碳酸钙成』分，可不pH。

　　四、过滤

　　配成的培→养基，若无特殊要求，可省略此步。若有沉淀或浑№浊.需要澄清的.液体培养基可用油纸过滤。而固体培养基可用中⌒　间夹一薄层脱脂棉的↑双层纱布过滤。如果过滤法还不能达到澄清的要求，则可用蛋清澄▓清法，即培养基加热冷却到50~60℃，装入三角瓶内(不超过容量的二分之一)，按1000mL加人1个～2个鸡蛋的▲蛋清，用力摇晃3-5min，高压蒸汽灭菌121℃、20min，取出趁热过滤即可。

　　五、分装

　　配制好的培▽养基根据不同的用途分装在『三角瓶、试管等容器中，分装试管，如果试管量很大，可用自动分液器，如果试管♀量少，可用漏斗分装。分装量不超过容器容积的三分之二。三角瓶以〗不超过容积的二分之一为宜;琼脂斜面以不超过试管长度的五⌒　分之一为宜，灭菌后，摆成的斜面为培养基量的三分之一，底层为三分之二的量为宜;半固体琼脂分装量为试管长度的三分之一;用来接种或保菌的高层琼脂，分装量为试管长度的四分之一或三分之一，用来接种厌氧菌的要达到三分之二;琼脂平板，内径为90mm的以13mL~15 mL为宜，内径70mm的平板为8mL~10 mL，制成的琼脂平板若表面水分较多，可将平板倒扣，放置在37℃培养箱内30min，干燥后再用△。每批培养基应另外分装一小玻∮璃瓶(约20mL)与该批培养基同时灭菌，为测定该批培养基最终pH。

　　六、灭菌

　　分装好的培养基应立即进行灭菌。灭菌的方法种类如下：

　　1. 高压蒸汽灭菌法

　　大多耐热培养基都可用▂此法，小量分ㄨ装时，用121℃，15min;灭菌量大时，用121℃，30min灭菌;含糖类的培养基只能113~115℃，15min灭菌，避免糖类遭破坏。

　　2.煮沸灭菌法

　　对含有不耐高温物质的培养基，可使用此方法。

　　3.过滤除菌

　　以过滤的方法除菌，用无菌操作技术，定量加入∩培养基。血液、抗生素可用无菌操作技术抽取，加入冷◥却到50℃左右的培养基中。培养基含有不耐热的物质时，可用此法。

　　对LST培养基进行灭菌时，有时发酵管内会有气泡。为防止◥发酵管内产生气泡，可以采取以下几项◣措施：

　　1. 小倒ぷ管浸满培养基(不留气泡)后再加入到盛LST的试管中。

　　2.灭菌锅关闭放气阀前，将锅内气体排干净。

　　3.试管塞不要塞得太紧(使用硅胶塞的时候)，勿使用橡皮塞。

　　4不要过早打开灭菌锅，要等灭◣菌锅内气压和温度都降到与室温一致或相差不大时再打开灭菌锅。

　　如果∩以上情况都做到还有气泡，可用水做培养基组的对照试验，若培养基组有气泡，而对照组没有气泡可确定是培养基自身的原因。

　　七、倒平板

　　灭菌融化的培养基冷却到50℃后，倒入无菌干燥的培养皿中。培养基的温度不能＠ 过高，否则容易在培养皿的内盖上形成太多的冷凝水;温度太低，培养基又容易凝固成块，无法制成平板。倒平板时，应在靠近酒精灯火焰进行，以免外界的杂菌落入平板内，左手拿培养皿，右手拿三角瓶的底部，用左手的小指和手掌部位把三角瓶的棉塞▽拔下，灼烧瓶口，用大拇指和食指把培养皿盖打开一条缝，至瓶口刚好伸入，倒入培养基，以铺满底为限，不超过培养皿●高度的三分之一，迅速盖好盖，放在︻桌面上，轻轻地转动培养皿，使培养基分布均匀，冷凝后即可。

　　八、摆斜面

　　装在试管中的琼脂培养基，在灭菌完成后，趁热立即摆放在木棒(或玻璃棒)上，并□　成适当的斜度，冷却后，琼脂凝固即成斜面。斜面长度不用ξ超过试管二分之一。

　　九、质量检查

　　培养△基灭菌后仔细检查一遍，发现有破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染，都要丢弃，不能再用。并测定其最终pH。还需进行无菌检查和效果检查。无菌检查是将灭菌后的培养基取1管(瓶)~2管(瓶)，37℃恒温培养1d～2d，确♀定无杂菌生长;效果检查是用标准菌株接种在相关▂的培养基上检查检查菌的生长、形态及生化情况，与已知情况相符。两种情况都合格，配制的培养基方可使用。