1.琼脂糖电泳

　　(1)取一定量的待测DNA样品，用适当的限制性内切酶酶切。DNA的量根据样品的种类及

　　实验目的的不同而⊙异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取0.1-0.5μg即可;而对于鉴

　　定基因组DNA中的单拷贝基因序列，则需要10～20μg;当采用寡核苷酸探针或探针的比放射

　　性活性较低时，则需要30～50μg。

　　(2)酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳。

　　(3)电泳结束后，EB染色，长波紫外线下观察电泳结果及照相。

　　2.印迹转移

　　(1)切胶并作标记(左下〓角切除)，以便于定位，然后将凝胶置于一容器中。

　　(2)将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温下放置1h 使之变性，不◥间断地轻轻摇动。

　　(3)将凝胶用去离子水漂洗1次，然后浸泡于◢适量的中和液中30 min，不☉间断地轻轻摇动。更换中和液，继续浸泡15 min。

　　(4)将滤纸，NC膜剪成与胶同样大小，NC膜浸入转移buffer 中平衡30 min。

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　　(5)按图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡■和皱折。

　　(6)虹吸转移12-16h。

　　3.固定DNA

　　(1)取出转移后的NC 膜，用滤纸吸干NC 膜，NC 膜光面朝上平铺于变性液中变性5min。

　　(2)用相同的方▓法将NC膜平铺在中性液上，中和两遍，每遍5min。

　　(3)将膜夹在两张干燥滤纸间♂，80℃烘烤1-2h。

　　4.预杂交

　　(1)将膜浸入5×SSC 中 2min，将膜放入干净的塑料袋中。

　　(2)将预杂交液事先在65℃ 预热，然后将10 ml 预杂交「液加入袋中，封口。

　　(3)65℃预杂交1h 以上，不时摇动。

　　5.杂交

　　(1)取出杂交袋，剪去一角去除杂＠ 交液后，加入5ml 杂交液及5μl 变性探针，排除气※泡后封口。

　　(2)将杂交袋放入65℃ 水浴中杂交过夜。

　　6.按下列条件洗膜

　　2×SSC, 0.1%SDS 50ml 室温5min /2 次

　　0.1×SSC, 0.1%SDS 50ml 65℃ 15min /2 次

　　7.免疫酶联检测

　　(1)偶联反应

　　①用中☆和液洗膜2min，室温。

　　②用封闭液50ml 洗膜30min，室温，轻摇。

　　③用中和液将稀释抗体-Dig –Ap 至 750 mU/ml ，将膜封↙入杂交袋，加入5 ml稀释抗体轻摇50min。

　　④用中和液50 ml 洗膜，10min ×2 次，室温，轻摇，除去未结合的抗ζ体。

　　(2)显色反应①用平衡液20 ml平衡膜2min。

　　②将膜装入杂¤交袋中，加入5ml 显色液，避光30min 左右，当出现颜色时不要晃动。

　　③用TE洗膜终止反应〖。

　　④80℃烤干。

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