1、聚丙烯酰胺的合成和结构
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Acrylamide简写为Acr)和交联剂甲叉双丙烯◇酰胺(N，N1-methylene-bisacrylamide，简写Bis)在催化剂的作用下，聚合交联成含有酰胺基侧链的脂肪族大分∩子化合物。上海创赛∏科技提供110-26-9，甲叉双丙烯酰胺,N,N'-Methylenebisacrylamide,高纯,99% ，商品编号：D23-S14002-100g，价格158元。
催化剂有两个∑ 系统可供选用。
(1)过硫酸胺-四甲基乙二胺(N、N、N、N-Tetramethyl-ethylene Diamine，简写TEMED)系统，其中过硫酸铵是引发剂。它在光照射下裂解成带有自由基的硫酸铵，通过自由基的传递，使丙烯酰胺▽成为自由基，发动聚★合反应。TEMED是加速剂，加快引发剂释放自由基的速度。
(NH4)2S2O8→→→→→(NH4)2SO4
(2)核黄素-TEMED 系统，其ζ中核黄素是引发剂，TEMED 是加速剂。这一催化剂系统需较强的光线和少量氧。上海创赛科技↙提供83-88-5，核黄素，Riboflavine，98%，商品编号：C16-R10027-100g，价格395元。
聚丙〖烯酰胺凝胶具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离不仅取决于各组分所带电荷的多少，也▲与分子大小有关。凝胶网孔的大小主要受成胶物的总♀浓度及Acr 和Bis 的比例的影响。一般电泳采用成胶物质总浓度为7.5%，此浓度称为标准凝胶浓度。如果改变总胶浓度，也应相应改变Acr和Bis的比例。
总胶浓度▂为↓5%以下时，Acr：Bis在20左右。
总胶浓度Ψ为5~10%时， Acr：Bis在40左右。
总胶浓度为5~20%时， Acr：Bis在125~200左右。
实验中应根据分子∴量大小，选择合适的凝胶总浓度和Acr和Bis的比例。
2、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是在聚丙烯酰胺凝胶支持物的々介质缓冲液组成、缓冲液pH、凝胶孔径和电势梯度不连续的条件下进行的电泳。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有较高的分辨率。这是因为分离过程中不仅有电荷效应和分子筛效应(存在于ξ 分离胶中◥)，而且还有一种独特的浓缩效应。下面简单介绍不连续园盘电泳的基本原理：
(1)浓缩效应
不连续园盘电泳一般是☉在小玻璃管内进行的。把三种性质不完全一样的聚丙烯酰胺凝胶重叠起来。如图4-3所示，上层为样品胶，中间为浓缩胶，这两层胶的凝胶浓度为3%是大孔胶，应用Tris-HCl 缓冲液，其pH6.7。下层◇是分离胶▓，此层凝胶总浓度为7.5%，是小孔胶，也用Tris-HCl 缓冲液，pH8.9。上下电极槽缓冲液是Tris-甘氨酸缓冲液，pH=8.3。通电后，向阳极泳动的阴离子有三种，即Cl -，蛋白质阴离子(Pr -)和甘氨酸阴离︼子(Gly -)。在样品胶及浓缩胶pH=6.7 的环境下HCl 全部电离为Cl-，甘氨酸仅极少部分电离为⌒Gly-(甘氨酸pI=6.0)，一般酸性蛋白质也解离为阴离子。这样，Cl –泳动最快(称快离子)，Gly-泳动最慢(称慢离子)，蛋白质介于其间。通电后，快离子很快超过蛋白质离子和Gly-，泳动到最前面。于是，快慢离子之间形成一个离子浓度低的区域，即低电导区∩域，低电导区域有较高的电压梯度。电压梯度驱动慢离子加速泳动。这样，当快慢离子移动速度相等时，就建立一个不断向阳极移动的界面。Pr –的泳动速度恰好介于快慢离子之间。因而被挤压在快慢◢离子之间形成一条窄带。这种浓缩作用可使蛋白质浓缩数百倍。血清蛋白在纸上电泳和醋酸纤维素薄膜电泳上仅★可分成5-7个组分。而在聚丙烯酰胺凝胶电泳上则可以分为20-30个组分。
(2)电荷效应
蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的高浓度蛋白质区，但由于每种蛋白质∞分子所带有效电荷不同，因而泳动率也不同，因此各种蛋白质就按泳动率快慢顺序排列成一个一个圆盘区带。在进入分离胶卐时，电荷效应仍起作用。
(3)分子筛效应
当被浓→缩的蛋白质样品从浓缩胶进入分离胶时，pH值和凝胶孔径突然改变，选择♀分离胶的pH 值8.9 接近甘氨酸的Pka 值(9.7-9.8)，这样慢离子的解离度增大，因而它的有效↙泳动率也增加。此时慢离子的有效泳动率超过了所有蛋白质的有效泳动率。这样，高电势梯度不存在Ψ了，各种蛋白质仅会由于其分子█量或构型的不同，在一个均一的电势梯度和pH 条件下，根据其通过一定孔径的分离胶时所受阻滞程度的不同，表现出不同的泳动率而被分开。上海创赛科技提供4530-20-5，叔丁氧羰基-L-甘氨酸，≥98.5%，商品编号：D16-1000956-25g，价格204元。
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