一、操作方法

　　1、培养液中按1%的体积加双抗(含青霉素1万U/ml，链霉素0.01g/ml)及肝素液(含肝素100U/ml)。用3.5%NaHCO3液调pH值为7.2~7.4，然后加灭活的小牛血清，使浓度为20%。再加PHA(50U~75U/ml)，无菌分装于№培养瓶内，每瓶1ml。上海创赛科技提供57-92-1，链霉素(标准品)Streptomycin，商品编号：C84-9623-200mg，价格77元。

　　2、无菌操作采血，并以肝素抗凝，同时进行白细胞计数及分◣类计数。

　　3、取0.1ml抗凝血，加入到含1ml培养液的培养瓶中，每个血样︽接2~3个培养瓶。如果以血浆或分⊙离的淋巴细胞代替全血，加入培养瓶中更好。上海创赛科技提供人抗凝血酶3Elisa试剂盒，Human Antithrombin III，AT III ELISA Kit，商品编号：LH-E10215HU-96T，价格1700元。

　　4、37℃培养72h，在培养结束前16h～24h，每瓶加入3H-TdR 1uci。

　　5、培养结束后，将培养物移到离心管内，用3%冰醋酸6ml，分〗两次冲洗培养瓶，并将冲洗液也装入离ω心瓶中，2 000r/min离心10min，去上清。沉淀再用3%冰醋酸洗∩涤一次，同样』离心去上清。

　　6、在沉淀中加30%H2O2液一滴，85℃水浴15min，待溶液呈无色时，再加甲酸0.5ml，继续加热(85℃)30min，使沉淀物完全消化溶解。

　　7、将消化溶解的∞液体移入测样杯内，用红外灯或80℃热空气烘烤至液体体积少于0.1ml，加闪烁液5ml，用★液体闪烁液计数器测其脉冲数。上海创赛科技提供132-98-9，青霉素V钾，Penicillin V potassium salt，分析标准品，商品编号：C16-P11203-100mg，价格395元。

　　8、第5~7步骤制备闪烁液☆样品也可以采用滤膜法制备。即：培养结束后，将培养液移入离心管，2000r/min离心10min，弃上清，沉淀用生理盐水洗涤一次、再离心。将沉淀移至滤◣膜上(注意将沉◆淀全部移入)，减压抽滤，并依次以10ml生理盐水、5ml 5%三氯醋酸(若√有带色物质，用30%H2O2液脱色)和3ml无水乙醇抽〓滤。取出滤膜，60℃~80℃烘干，然后将滤膜放入装有5ml的闪烁液中(贴细胞的面朝上)，用液体闪烁液计数器检测。

　　二、结果判定

　　以液体闪烁※计数器测定每分的脉冲数cpm。取各管测定≡读数的平均值，即为0.1ml血¤样的脉冲数。全血检测的脉冲数，再按血样淋巴细胞计数结果，校正成每百万淋巴细胞的脉冲数(cpm/106淋巴细胞)。也可以刺激指数(SI)表示〇试验结果。为此须在培养时」，设同样数量的不加PHA的对照培养瓶，试验管脉冲数与对照管脉冲数之比，即为刺激指数。

　　三、注意事项

　　1、血样与培养基比例一般在1：10~1：30为宜。

　　2、培养细胞时，可放入CO2培养箱中培养，也可在普通温箱进行培养，但一定要把盖子拧紧，否则结果差别较大▂。

　　3、以SI表示结果█时，一定要设置相同数量培养管的对照(即不加PHA)。而以cpm绝对值表示(cpm/106淋巴细胞)则可以不用设对照管。因为对照的cpm与本底比较接＠近，不同样品之间的少许差别也不易确定其意义。

　　4、闪烁液的容水量很低，所以在加入闪烁液之前必须烘干。但加入一定量的醇类(如无水乙醇)，则可容纳少量的处理后所残留的水分，但也仍需烘至接近干燥的程度，否则将〖发生浑浊而无法测定。据报道，如果闪烁液中加㊣　入1/3的异辛基苯氧聚ξ　乙氧乙醇(TritonX-100)，其容←水量可达15%，消化溶解后的样品，不必烘干，即可添加闪烁液测定。

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