饲养层细胞(Feeder)的制备

　　注：含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基(FBS占10%)(实验室所用MMC为10 mg/mL，Calbiochem)

　　1.弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基(DMEM+10% FBS);上海创赛科技提供丝裂霉素C,Mitomycin C,≥970 µg/mg,USP31,BR,可用于细胞培养,50-07-7,商品编号：C84-1164-5mg，价格259元。

　　2. 放入培养箱培养3小时(2-4小时);

　　3. 用0.1% 明胶处理培养皿(将明胶加△入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可)，室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止;上海创赛◎科技提供明胶，Gelatin,商品编号：B11000719-100g，价格241.5元。

　　4. 弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2-3 mL PBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次(必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性);

　　5. 加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可(如细胞过稀，可再补加丝裂霉素处理过的细胞)，半小时后即可使用(如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上)，可使用6-10天，用前更换培养液(如未用明胶处理█培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用;最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做)。上海创赛科技提供8049-47-6,胰酶(11×USP)，Pancreatin-11.0 from hog pancreas,商品编号：C84-0033-100g，价格364.8元。

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