TFAR19(PDCD5)是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素(FITC)标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸(PS)外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。
进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的Ψ 核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核Ψ转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。
(一)TFAR19蛋白的细胞定▅位分析
材料试剂：
FITC标记的单克隆抗体，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T(pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20)，胎牛血清，荧光细胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛【血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip头，移液器。上海创→赛科技提供多聚甲醛，30525-89-4，Paraformaldehyde ,T,88.0%,商品编号：C12-P0018-25G，价格109.25元。
仪器：
低温水平离心机, 37°C水浴箱，荧光显微镜，共聚焦激光扫描①显微镜，流式细胞计
方法：
1 悬浮细胞的染色：
(1)收获正常和ㄨ诱导凋亡的细胞(0.5~1′106)，PBS洗2次，1000rpm′10min。
(2)3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
(3)加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。上海创赛科技提供PBS-Tween20洗液，BR ,商品编号：D16-1028505-500ml，询价。
(4)加入200ml胎牛血清，室温反应30min。上海创赛科技提供标准胎牛血清，Standard Fetal Bovine Serum ,商品编号：B11-S9030-200ml，价格360元。
(5)加入5ml FITC标记的TFAR19单抗(终浓度为1：40)，4°C反应30min
(6)荧光细胞洗液洗2次，1000rpm 10min。
结果观察：
将细胞沉淀滴片，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。
2：贴壁细※胞的原位染色：
(1) 贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中(内有洁净盖玻片)，让其爬片生长→，待长到 50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。
(2) 将不同时间点处理的细胞进行︽免疫荧光染色，染色步骤同上。
(3) 将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油(5ml)的载玻片¤上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微 镜观察TFAR19在细胞中的定位。
3：临床病理切片的染色、检测。
4：原代细胞的培养、检测。
5：分析TFAR19蛋白在人体内各组织¤器官的分布及定位
(二)TFAR19蛋白的表达与临床疾病
ELISA法检测正常人和疾病状态下，以及疾病的不♀同时期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗◤体水平。
材料和试剂：
1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸盐Buffer 上海创赛科技提供缓冲液pH8.7(6mol/L的盐酸胍),Buffer Solution(Guanidine Hydrochloride) ,商品编号：C12-B2904-100ML，价格598元。
2. 洗涤液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
3. 封闭液： 3%BSA(用洗涤液配制)
4. 酶标抗体的稀释：用封↓闭液稀释
5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g 柠檬酸 0.51g DDW 100ml
6. 显色液(现配现用)：底物Buffer 10ml OPD 2mg 30% H2O2 2ml
7. 终止液 2Mol/L H2SO48. 重组人TFAR19, HRP标记的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA Reader(OD490nm)，洗板机
操作步骤
1. 用包被Buffer稀释的重组人TFAR19(1mg/ml)包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C过夜(一般24h以上)。
2. 洗涤Buffer洗板三次，加入ω封闭液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C 过夜。
3. 洗涤Buffer洗板三次，加入⊙不同稀释度的病人血清(3个重复孔)100ml/well ，37°C孵育1h。设包被Buffer、洗涤Buffer 、封闭液为阴性对照。
4. 洗涤Buffer洗板三次，加入1：2500稀释的HRP标记的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。
5. 洗涤Buffer洗板三次，加入显色液，100 ml/well，避光反应10~15min。
6. 加入H2SO4终止反应，50 ml/well。
7. ELISA Reader 读取OD490 光密度值，分析№和比较病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗体的表达水平。
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