YIJI组织 AMPK激酶活性比色法定量检↘测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
YIJI组织 AMPK激酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到 AMPK磷酸化后，进而
由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生 ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核
苷酸（NADH）的』氧化反应，即采用比色法测定其氧化后吸光峰值的变化，以分析组织⊙裂解样品中 AMPK
活性的权威而经典的技术方法。该技■术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂
解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中 AMPK 激酶的定∩量检测，以及『抑制剂和激活剂的
筛选。产品严格无□菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。
技术背景
5’AMP活化〒蛋白激酶（5’AMP activated protein kinase；AMPK）属于丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine
protein kinase）家属成员之一。其为从酵母到人体高度进化保留的激酶复合物，由3个亚体，α、β、γ构
成：其中γ亚体有4个胱硫醚β合酶（cystathione beta synthase；CBS）结构域，又称为巴特曼（Bateman）结
构域，以探测AMP和ATP的比例；α亚☆体含有催化结构域，一旦收到AMPKK或LKB1/MO25/STRAD 复合
物催化的磷酸化后，AMPK被激活。所有亚体都有不同异构体形式，包括α1、α2、β1、β2、γ1、γ2
和γ3。其功能在于保持细胞能量内环境恒定：促进脂肪酸β氧化、抑制胆固醇合成、促进肌肉葡萄◣糖吸收
和调节胰岛素分泌等。AMPK在肝脏、脑和肌肉组织中高〓度表达。其磷酸化◣目标序列为 LKKLTRASFFGQ。
基于底物LKKLTRASFFGQ，在ATP的存在下，受到5’AMP活化蛋白激酶的〓磷酸化，获得产物磷酸化多肽，
进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应▲系统中，还
原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌
呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的变化（340nm），来定¤量分析5’AMP活化
蛋白激酶的活性。其反应方式为：
产品内容
YIJI清理液（Reagent A）
YIJI裂解液（Reagent B）
YIJI缓冲液（Reagent C）
YIJI酶促液（Reagent D）
YIJI反应液（Reagent E）
YIJI底物液（Reagent F）
YIJI阴性液（Reagent G）
保存方式
保存 YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避〇免光照和反复冻
融；有效保证6月
1用户自备
AMPK激酶：用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器『
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
比色皿或酶标板：用于比色分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪▃：用于样品比色分析
实验步骤
一、 待测样品准备
1． 手术取出动物▓组织，并秤重 500毫克组织重量
2． （选择步骤）放进预冷的 15毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入
毫升 YIJI清理液（Reagent A）清洗
4． （选择步骤）抽去清理液ξ
5． 移入到一个液氮卐冻存管
6． 即刻放进液氮罐过夜
7． 次日从液氮▼罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
8． 放进一个 15毫升锥形离心管
9． 加入置于冰槽里㊣ 的
微升 YIJI裂解液（Reagent B）
10．强力涡旋◆震荡 30秒，充分混匀
11．放进冰槽里孵育 30分钟，期间每 10分钟〗强力涡旋震荡 30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱
里储存备用）
12．即刻放进 4℃台式离心机离心 10分钟，速度为 10000g
13．小心移取㊣上清液到新的无菌的 1.5毫升离心管
14．移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 YIJIBradford 蛋白质浓度定量试剂盒－
YJ30030.1）
15．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备△用
二、 测定准备
1． 准备好⌒待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里
2． 设定好分光光度仪（温度为 30℃）：波长为 340nm，间隔 1分钟，读数 6次（共 5分钟），并置零
三、 背景对照测定
1． 移取
2． 加入
3． 加入
微升 YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色↑皿
微升 YIJI酶促液（Reagent D）
微升 YIJI阴性液（Reagent G）
4． 放进 30℃培养箱里静置 2分钟
5． （选择步骤）放进分光光度↓仪，置零
6． （选择步骤）取出比色ぷ皿
2
7． 加入
8． 加入
微升 YIJI反应液（Reagent E）
微升 YIJI底物液（Reagent F）
9． 上下︼倾倒数次，混匀（限定在 3秒之内）
10．即刻放进Ψ 分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数 0分钟 －340波长读数 5分钟
四、 样品测定
1． 移取微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入微升 YIJI酶促液（Reagent D）
3． 加入 5微升待测样品（注意：50微克细胞裂解悬液▃蛋白；样品须溶解）
4． 放进 30℃培养箱里静置 2分钟
5． （选择步骤）放进分光光度仪，置零
6． （选择步骤）取出比色皿
7． 加入微升YIJI反应液（Reagent E）
8． 加入升YIJI底物液（Reagent F）
9． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3秒之内）
10．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数：340波长读数 0分钟 －340波长读数 5分钟
五、 计算样品活性
单位＝微摩尔 NADH/分钟
六、酶标板测定
1． 在 96孔酶标板上做∩好相应标记：背景对照和样品
2． 分别移取微升YIJI缓冲液（Reagent C）到 96孔板中
3． 分别加╱入微升 YIJI酶促液（Reagent D）
4． 分别加入 5微升 YIJI阴性液（Reagent G）或待测☆样品（50微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔
中（注意：样品须清澈）
5． 轻轻摇动 96孔酶标板
6． 在 30℃温度下孵育 2分钟
7． 分别加入微升YIJI反应液（Reagent E）
8． 分别加入微升YIJI底物液（Reagent F）
9． 轻轻〖摇动酶标板
10．即刻◣放进酶标仪检测：0分钟读数和 5分钟读数
11．活性计算：
单位＝微摩尔 NADH/分钟
七、抑制剂筛选
3
1． 在 96孔酶标板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑→制剂样品
2． 按下表加入试剂
内容物
样本背景
微升
完全Ψ酶活性
微升
待测抑制剂酶︻活性
微升
YIJI缓冲液
（Reagent C）
YIJI阴性液
（Reagent G）
待测抑制剂
微升
——
——
微升
——
――
微升
用户自备的纯化酶
96孔板∑每孔总量
微升（1毫单位）
完全活性孔
（ 微升）
微升（1毫单位）
待测抑制☆剂样品孔
（ 微升）
样本背景孔
（ 微升）
3． 轻轻摇动☉酶标板，混匀
4． 放进 30℃培养箱里静置 30分钟
5． 分别加入
6． 分别加入
7． 分别加入
微升 YIJI酶促液（Reagent D）
微升 YIJI反应液（Reagent E）
微升 YIJI底物液（Reagent F）
8． 轻∏轻摇动酶标板
9． 即刻放进酶标仪检测：获得初始吸光√读数（OD）
10．放进 30℃培养箱里孵育 30分钟
11．即刻放进酶标仪检测：获得终点〖吸光读数（OD）
12．实际吸光读数：初始吸光读数（OD）—终点吸光读∩数（OD）
13．抑制活性计算：
1)
2)
IC50：50％抑制率所需●的抑制剂浓度
3） 直接构建抑制曲线：纵座标（Y轴）为吸光读数 OD；横座标（X轴）为已知抑制剂●浓度
注意事项
1． 本产品为 25次操作，包括背景操作
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操◣作过程中，背景测定只需 1次
4． 样品处理忌用磷酸缓∏冲溶液
5． 样品须澄☆清，至关重要
6． 加入 YIJI底物液（Reagent F）后 3秒内即刻比色测定
7． 测定值由ξ高到低变化；测定可持续 30分钟
8． 比色测定后，比色皿须清洗彻底
9． 样本测定 0分钟读数高于 5分钟读数表明具有酶活性
10．建议待测样ζ本蛋白浓度为 50 微克/5 微升（本公司提供 YIJIBradford 蛋白质浓度定量试剂盒－
YJ30030.1）
11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
4
12．可以使用 AMPK抑制剂（DORSOMORPHIN）作为抑制剂对照或阴性对照
13．5’AMP活化蛋白激酶活性单位浓度定义：在 30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟ω 内能够氧化 1微摩尔
还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位◥
14．本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感
