修饰№肽纯化的一般目标和方法
首先，自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤(例如：匀浆、离心、硫酸铵沉淀等)成为稳定的可以用于色谱分离的样品。
然〖后进行捕获色谱(capture chromatography)，主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的√杂质，此步最关心的是流速和载量，常采用高载量、快流速凝胶。
经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱(intermediate chromatography)，目的是去除较难去除的杂█质，此步●最关心的是分辨率，常采用高分辨率的细颗⌒ 粒凝胶。
最后为了得到符合要求的︾最终产品，去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断，进行精制色谱(polishing chromatography)，常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝╳胶进行凝胶过⊙滤色谱。
2、修饰肽纯化卐前的准备工作
(1)样品稳定性试验
a、测定①样品在pH 2-9的稳定性;
b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性;
c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性;
d、测定样品在4-40℃的稳定性;
e、室温下ㄨ静置过夜，测定对蛋白水解酶的稳定性。
(2)样品预处理
a、去除样品中颗粒物(0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟)
b、去除样品中↘脂类( 10000 g离心15分钟或有机溶▓剂抽提)
c、去♂除样品中核酸(加入核酸酶消化或者使核酸沉淀)
d、抑制样品中蛋白◥水解酶(加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第一步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白)
(3)样品的保存条件※：
短期储存(小于24小时)
a、避免接近或超过样品㊣ 的稳定极限防止蛋白↘质变性或沉淀
b、在密闭容器中冰箱冷藏ぷ
较长期储存(数天)
a、b、同上
c、加入适当的抑菌剂
长期储存
a、同上
b、冰冻或者最好冻干(真空冷冻干燥)保存。
3、对每一纯化步骤的评价相关方法㊣的建立a、目的蛋白含】量测定
酶活╲性测定、生物「活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。
b、总蛋白含量测定
紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法(考马斯¤亮兰G-250)等。
c、样品复杂度检测
HPLC(离子交换、凝胶过滤、反相)、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳←(CE)。
4、蛋白质的＠ 来源
(1)天然蛋白： 天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂，在分离过程中须采用多步骤才能去除各种杂质，并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。
(2)重组蛋白： 重组蛋白■则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要有三种表达定卐位：
a、细胞质：在种〖情况下╲，必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质，同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放;在表达量较高的条件下，一般形成包涵□体，包涵体含有过表达目的蛋白，且容易通过高♂速离心分离，但是包涵︻体的溶解与复性是较复杂的。
b、外周质： 表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间，这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的作用并减少了宿主蛋白的污染。
c、分泌到培养基：这种表达一般蛋白质浓度较低，主要受☆到培养基中的污染。
