双甲脒（amitraz）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。1 使用目的： 本试剂盒用于饲料、鱼、虾和肉类组织（如鸡、牛肉和猪肉），鸡蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿样中双甲脒（amitraz）残留的定量检测。2 实验原理本试剂盒采用直接竞争 ELISA 方法，在微孔板包被有双甲脒（amitraz）偶联抗原，加 入双甲脒（amitraz）标准品或样品，游离双甲脒（amitraz）与微孔条上预包被的双甲脒（amitraz） 偶联抗原互相竞争抗双甲脒（amitraz）抗体酶标记物，用 TMB 底物显色，加入终止液后颜 色由蓝色变为黄色，用酶标仪在 450nm 波长下进行︾检测，吸光值与样品中双甲脒（amitraz） 含量成反比，通过标准曲线计算样品中双甲脒（amitraz）的含量。3 试剂盒组成3.1 预包被的双甲脒（amitraz）偶联抗原的可拆酶标板：1 块（12 孔×8 条）。3.2 双甲脒（amitraz）标准品：6 瓶（1ml/瓶），含量卐分别是：0 ppb，0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7 ppb,8.1 ppb3.3 抗双甲脒（amitraz）抗体酶结合物：1 瓶（6ml）。3.4 显色液 A：1 瓶（6ml）。3.5 显色液 B：1 瓶（6ml）。3.6 终止液：1 瓶（6ml），2M 硫酸。3.7 样本稀释液：1 瓶（10×, 6ml），用于样品稀释用。3.8 浓缩洗涤液：1 瓶（20×，20ml），用于洗板。3.9 说明书一份。4 需要而未提供的材料4.1 设备4.1.1波长450nm酶标仪。4.1.2粉碎机。4.1.3量筒。4.1.4振荡器。4.1.5漏斗。4.1.6Whatman No 1或相当的滤纸。4.1.7微量移液器。4.2 试剂4.2.1去离子水或蒸馏水。4.2.2 甲醇。5 贮存5.1 试剂盒◤贮存于2~8℃，切勿冷冻5.2 未用完的微孔板应该密封干燥保存6 注意事项6.1 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。 6.2 不要使用过期试剂盒。6.3 试剂盒使用前，将试剂恢复至室温（25±2℃），建议至少回温⊙2小时。6.4 标准品中含有黄曲霉素，使用时应特别注意，操作时应带手套。6.5 终止液中含有硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。6.6 不同标准品←、样品所用吸头不能混用，否则会影响试验结果。6.7 不同批号试剂盒中的试剂不得混用；不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响 实验结果。6.8 稀释样本时必须用本试剂盒中的样本稀释液，否则会影响实验结果6.9 混合试剂时应避免起泡。7 工作液【准备7.1 双甲脒（amitraz）标准「品溶液：0 ppb，0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7 ppb,8.1 ppb7.2 浓缩洗涤液：用蒸馏水按1:20(1+19)稀释备用7.3 样本稀释液：备用7.3 显色剂：已备用，避免光线直照7.4 反应终止液：已备用8 样品处理程序（样品在提取过程中，要严格按说明书操作，提取过程中应↓准确稀释，否则 会出现结果不准确，样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存）8.1取10g粉碎的样品，加 20ml 70%甲醇溶液8.2强力振荡3分钟8.3用Whatman No 1滤纸过滤8.4取25μl处理后的样品，加入25μl样本稀释液于反应孔中（样本稀释倍数为2）9 酶免〖分析步骤9.1 实验须知9.1.1 实验开始前请将所有试剂于盒外充分恢复至√室温（25±2℃），时间约2小时。回温至室 温（25±2℃）后再取出微孔条，多余的微孔条重新密封立即于2~8℃干燥保存 注：一定保证回温充分，否则影响检测的精确度和准确度。9.1.2 使用后请立即将试剂放回2~8℃保存9.1.3 请不要改变分析程序9.1.4 请使用⌒　精确的微量移液器9.1.5 操作一旦开始，请不要中断任何程序9.1.6 ELISA结果的可重复性极大程度的取决于操作程序，请严格按照要求操作9.1.7 为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的吸头加样9.1.8 加样时请勿让吸头接触微孔中■的溶液或内表面9.2 分析步骤9.2.1 预先进行编号，标记B0、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测9.2.2 取所需数量的微孔（微孔条可拆），将多余板条重新密封并立即放回2~8℃保存9.2.3 样品稀释液（10×）、浓缩洗涤液（10×）稀释成工≡作液(蒸馏水或去离子水稀释)9.2.4 在B0孔中加入50μl0.0 ng/ ml标准品溶液9.2.5 在各标准孔中加入50μl的标准品溶液9.2.6 在各样品孔中加入50μl样品溶液9.2.7 在所有孔♂中加入50μl的抗∏黄曲霉素B1抗体酶结合物9.2.8 轻轻晃动反应板几秒钟。9.3 37℃温浴30min （温浴过程中不时轻拍反应板，可以减少双孔误差）9.3.1 甩掉孔中液体，用洗※液洗涤微孔板5次，最后一次应在吸水纸上拍打㊣　以完全除去孔中液 体。9.4 反应9.4.1 洗涤▂程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50μl显色液A，再加 50μl显 色液B；轻微晃动反应板使之彻底混匀9.4.2 37℃温浴10min9.4.3 每孔中加入50μl终止液，混匀9.4.4 在450nm下检测吸光度，结果在5min内读取。10 结果计算10.1定量分析10.1.1所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度□值的平均值（B）除以第一个标准（0标准） 的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸「光度值。 B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0—0μg/L标准溶液的平均吸光度值10.1.2以双甲脒（amitraz）浓度的对数值为X轴，百分吸光度々值为Y轴，绘制标准曲线图。根 据样←品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的＠ 横坐标，即为双甲脒（amitraz）浓度的对数 值，求得反对数即为测定液中双甲脒（amitraz）浓度C（ppb）10.1.3由ζ　于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释 倍数。10.2 半定量♀测定10.1.1目测半定量♀测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品吸光 度值的高低比较，判断样品浓度︻值是小于还是大于标准值。10.1.2仪器半□定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品颜色 深浅比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。11 特异性物质 交叉反应 双甲脒（amitraz）100%12 试剂盒参数 本试剂盒检测下限为0.05ppb B0吸光度最佳值应大于1.0试剂盒吸光度板内误差小于8％，板间误☆差小于15％。 用∮本说明书提供的组织样本提取方法回收率大于80％。13试剂盒提供的标准曲线范围为0.1ppb~8.1ppb。14 分析限制 本试剂盒检测为阳性的样品应该用另一种方法如HPLC或GC/MS加以确证。