验试剂

　　1. L-Leucine，ATP，DTT，焦磷酸钠(tetrasodium pyrophosphate)和HA-Ultrogel购自美国Sigma公司。

　　2. [32p]-焦磷酸钠购自美国杜邦公司。

　　3. L-[I4C]-亮氨酸和DEAE-SepharoseTM Fast Flow购自英国Amersham公司。

　　4. 限制性内切酶和T4DNA连接酶购自立陶宛MBI Ferments公司。

　　5. 质粒pTrc-99B。

　　实验材料

　　大肠杆菌LeuRS从高表达大肠杆菌菌株中纯化得到

　　实验步骤

　　1. 突变体LeuRS基因的构建

　　以构建的编码大肠杆菌LeuRS的基因leuS作为模板，利用两步PCR反应扩增得到六个LeuRS变种酶的基因〓序列。

　　一轮PCR反应的5’和3’引物：上下游引物分别具有NcoI和HindIII酶切位点，构建各突变所用的引物略。PCR反应产物经用NcoI和HindIII双酶切后，嵌入表达载体pTrc-99B的NcoI和HindIII两个酶切位点间的切口内。得到的LeuRS 6个变种酶基因的正ζ　确性用DNA测序证实。

　　2. LeuRS及其变种酶基因的表达和纯化

　　将含有LeuRS及其六个变种酶LeuRS-E292K，LeuRS-E292F，LeuRS-E292S，LeuRS-E292D，LeuRS-E292Q，LeuRS-E292A的基因的重组质粒转化到在【大肠杆菌菌株TG1中，挑选含有正确质粒的转化子至5 mL氨苄-LB液体培养基，37℃，300 rpm振荡培养转化子至对数生长期，用0. 5 mM IPTG诱导6小时，取出20ul培养液，加入等体积的SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮沸10分钟，离心取上清液进行SDS-PAGE检查转化子中各变种酶基因的表达情况。将高表◇达转化子5 mL菌液转接至500 mL氨苄-LB液体培养基中37℃，300 rpm培养至对数生长期，用0. 5 mM IPTG诱导8小时，收集菌体。将湿菌体悬⊙浮于20毫升0℃预冷的破菌缓冲液(50 mM磷酸钾缓冲液，pH6.8，含10 mM β-琉基乙醇，2 mM PMSF，10%甘油)中，冰浴超声波破菌。将破菌液于4℃，12,000g离心30分钟后继续经4℃，150,000g超离心1小时。取上清液经过DEAE-SepharoseTM Fast Flow和HA-Ultrogel两步柱层析纯化。在DEAE-Sephorose CL-6B fast flow纯化中使用的线性洗脱梯度为pH6.8的磷酸钾缓冲液50 mM-500 mM。在HA-Ultrogel纯化中使用的线性洗脱梯度为pH 6.8的磷酸钾缓冲液20 mM-300 mM。收集的含LeuRS以及变种酶的洗脱峰，用PEG 20000浓缩，对10 mM pH 6.8的磷酸钾缓冲液透析。加入50%0℃预冷的甘油，保存于-20℃。

　　3. 蛋白质浓度测定

　　粗抽液蛋白质的浓度用Bradford方法测定。纯化后的LeuRS以及变种酶的浓度可以通过以下公式计算得▅到：1 A280=1.62 mg/ml。

　　4. 酶活力测定

　　氨基酸活化反应的条件如下：35ul反应液中含有100mM HEPES (pH7.8)，10mM KF，10 mM MgCl2，4 mM ATP，2 mM [32P] PPi和1 mM亮氨酸，在37℃保温，用约4 nmol/L LeuRS起始反应，于不同时间，取出15ul反应液，加入200ul淬灭液中(3.5%高氯酸，2%活性炭和0.05 M焦磷酸钠)停止反应，在淬灭液中再加入5毫升10 mM焦磷酸钠溶液，用Whatman GF/C滤纸过滤以上溶液，收集吸附32P-ATP的活性炭粉末，依次用10 mM焦磷酸钠(2x5 ml)和95%乙醇(2x5ml)洗涤和抽干，烘干后，投入闪烁液，闪烁液为0.6%2-(4-叔丁基苯-5-(4-双苯基)1,3,4二唑[溶剂为乙二醇甲醚/甲苯(体积比为6/4)]，计数活性炭粉末吸附的32P-ATP的量。氨基酸活化反应活力的单位定义为在测定条件下，每分钟催化1纳摩尔PPi形成ATP所需ω　要的酶量。氨基酞化反应的条件如下：35ul反应液中含有100 mM Tris-HCl (pH7.8)，30 mM KCl，12 mMMgCl2，4 mM ATP，0.1 mM EDTA，0. 5 mM DTT，20uM tRNAleu，0.1mMC亮氨酸在37℃保温，用约5 nM LeuRS起始反应。不同时间取15ul反应液滴在Whatman 3#滤纸上((1.0cm×1.0cm)，放置5秒钟后，将纸片投入5%三氯乙酸中(含有5 mM亮氨酸)，0℃浸泡10分钟，换2次5%三氯乙酸溶液，再用95%乙醇浸泡两次，烘干滤纸片。投入PPO/POPOP闪烁液((5 g PPO0.25 g POPOP溶解于1L甲苯)，液闪计数。氨基酞化反应活力单位定义为:在测定条件下，每分钟催化产生1纳摩尔亮氨酞-tRNAleu所需的酶量。

　　5. CD光谱和荧光光谱的测定

　　测定CD光谱所使用的仪器为Jasco J-715型圆二色性仪。蛋白质样品在10 mM磷酸钾溶液ω((pH 6.8)中的浓度为0.2 mg/ml，测定温度为室温，所用比色杯的光径为0.lcm。荧光光谱的测定在日本Hitachi F-4010荧光分光光度计上进行。测定发射光谱时，激发波长为295 nm，狭缝为3 nm，发射光谱扫描范围为300-400 nm。荧光杯的光路长为1 cm。蛋白质样品在10 mM磷酸钾溶液(pH 6.8)中的浓度为0.1 mg/ml。