实验试剂 1. RIPA Buffer配制基础成分：Tris-HCl(缓冲液成分，防止蛋白变性)NaCl(盐份，防止非特异蛋白聚集)NP-40(非离子№去污剂，提取蛋白；用H2 O配制成10%储存液)去氧胆酸钠(离子去污剂，提取蛋白；用H2 O配制成10%储存液；避光保存)注意：准备激酶(致活酶)实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。RIPA蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存)EDTA(钙螯合剂；用H2 O配制成100mM的储存液，PH7.4)亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2 O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存)抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2 O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存)胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇■配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存)RIPA磷酸(酯)酶抑制剂激活的Na3 VO4 (用H2 O配制成200mM的储存液)NaF(200mM的储存液，室温保存)注意：在准备做磷▽酸(酯)酶实验的时ω　候，不加磷酸酯酶抑制剂2. 工作液配制配制100ml的modified RIPA buffer： 1) 称取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4 2) 加10 ml 10%的NP-40 3) 加2.5 ml 10%的去氧≡胆酸钠，搅拌，直到溶』液澄清 4) 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存 5) 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各♂100 μl; PMSF，Na3 VO4 ，NaF各500 μl)，但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应◥该在使用前现加，其他抑制剂︾成分可以在水溶液中稳定5天。各种成分在工作液中的终浓度： a. Tris-HCl：50 mM，pH 7.4 b. NP-40：1% c. 去氧胆酸钠：0.25% d. NaCl：150 mM e. EDTA：1 mM f. PMSF：1 mM g. 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂：各1 μg/ml h. Na3 VO4 ：1 mM i. NaF：1 mM实验步骤 准备工作：1. 预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子(用保鲜膜包好后▂，埋冰下)，离心机；2. 用预冷的PBS洗涤细胞两次」，最后一次吸干PBS；3. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107 个细胞、10cm培养皿或150cm2 培养瓶，0.5ml/5×106 个细胞、6cm培养皿、75cm2 培养瓶)；4. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液】转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min(EP管插冰上，置水平摇床上)；5. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个＠ 新的离心管中；6. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠∩子Ψ，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖▆部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；7. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%)，4℃摇晃10min(EP管插冰上，置水平摇床上)，以去除非特异性杂蛋白，降低背景；8. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子；9. (Bradford 法)做蛋白标△准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀▓释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量，分装后，可以在-20℃保存一个月)；10. 用PBS将总蛋♀白稀释到约1μg/μl，以降低裂〓解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白№浓度应该稍高(如10 μg/μl)；11. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异；12. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议︻用2 h室温孵育；13. 加入100μl Protein A琼脂糖◆珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl“过渡抗体”(兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG)；14. 14000rpm瞬时离心5s，收集☆琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂∮糖珠-抗原抗体复合物内部的∴结合，可以使用PBS；15. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬√起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要¤而定(60 μl足够上三道)；16. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼●脂糖珠，上清也可以卐暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。通过免疫共沉淀确定结合蛋白：1. 用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的▲适宜细胞。刮去每块板※上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中；2. 将每毫升细胞悬液々转移到微量离心管中，在微量离◥心机上4℃以最大速度离心15 min；3. 收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h；4. 加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4℃摇动免疫沉淀物30 min；5. 用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次；6. 吸出混合物↙的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加■样缓冲液到球珠中，煮沸4 min；7. 将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下【电泳过夜；8. 通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带；9. 从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两〖次，每次3 min；10.用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将」肽电洗脱；11.通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。