原位末端凋亡法(TUNEL)技术服务

　　服务项目简介

　　TUNEL细胞凋◥亡检测 (TUNEL Apoptosis Assay)是一种高灵敏度又快速简便的细胞凋♀亡检测方法。对于待检测的细胞或组织」样品，经过生物素标记和后续的DAB显色等步骤，即可在普通光学□　显微镜下观察到凋亡细胞。

　　细胞在发生凋□亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体∑　间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。 基因组DNA断裂时，暴露的3-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal DeoxynucleotidylTransferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，最后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋∮亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的∴细胞。

　　技术步骤

　　1. 材料与试剂 (以Promega试剂盒为例)，包括：

　　(1)生物素标记的-dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛标记的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP) 1 nmol/μL

　　(2)TdT酶(25U/μL)

　　(3)反应◣缓冲液

　　(4)洗涤缓冲■液

　　(5)异硫氰酸荧光素(FITC)标记的亲合素或链霉亲合素(2.5μg/mL)或抗地高辛√抗体(1︰30)

　　(6)PI染液(含PI 5μg/mL及无DNA酶活性的RNA酶0.1%)

　　(7)PBS缓冲液

　　(8)塑料盖玻片

　　2. 样品

　　(1)悬浮生长培养细胞的甩片或涂片

　　(2)贴壁生长①的培养细胞

　　(3)冰冻切片

　　(4)常规石╳蜡切片

　　3. 操作方法

　　(1)固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚⌒　甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h(-20℃)。常规4%中性福尔马林固定、石蜡包埋之切片◥进行脱蜡№、水化。

　　(2)洗涤：玻片浸入PBS缓冲液，摇床上洗涤5min，三次。

　　(3)反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞』或组织周围∏水分，按50μl/cm2滴加♂反应液(每50μL反应液含TdT酶0.5μL,标记的-dUTP 1μL)，使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上，盖上塑▼料盖玻片，置湿盒中，37℃孵育1h。

　　(4)终止反应：去掉塑料盖玻片，将玻片置盛有洗涤缓冲液的染色缸内，洗涤两次，每次5min。

　　(5)FITC标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞※或组织周围水分，按50μl/cm2滴加FITC反应液(含FITC 2.5μg/mL)，室温下避光孵育10min。

　　(6)洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液〗内，洗两次，每次5min。

　　(7)PI复染：将玻片置于盛有PI染液的染色︾缸内，室温下避光染色30min。

　　(8)封片：用盖玻片直▽接盖在含PI染液的玻片上】，亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，尽早镜检观察。

　　4. 结果判定：用荧光显微镜】观察，选用蓝色激发光(波长488nm)，所有〗的细胞核均被PI着色，显示出红々色荧光，而凋亡细∑胞被特异地标记上FITC，显示出黄绿色荧光。

　　应用领域

　　细胞凋亡(apoptosis)的分析方法，细胞凋亡有一项重要的特征为细胞内的DNA会碎裂成片段(DNA fragmentation),TUNEL可以有效的⊙去探测DNA片段▲的产生。

　　服务周期

　　交货时间： 15~20天

　　客户须知(对材料的要求、注意事项)

　　结果提供：正常和阳■性对照玻片及其1张数码照片，剩余石蜡块，检测报告;

　　样本要求：取材保持组织新鲜(组织块以小▂于2cm×1.5cm×0.3cm为宜)，立即□放入固定液中(固定液用10%福尔马林液或4%多聚甲醛缓冲↑液，体积◤为组织块的10倍以上)，避免干燥;对于有血迹的样本，可用PBS液或生理盐水冲洗后直接放入固定液中;经固定后的样本必①须在48小时内处理。

　　联系我们：

　　上海恒远生物科技有限公□　司