设备和材料

　　1. GDS-80 基因枪配口径 4.5 mm的枪管，压力调节器和软管(WGB09O001)(Wealtec)

　　2. 无菌操作台

　　3. 3 cm目标间隔件(Wealtec)

　　4. 纯度 99.999%氦气

　　5. 样本：玉米胚芽(Zea mays L. embryo.)

　　实验步骤

　　1. 调整 GDS-80基因枪输出压力设置，并在实验前按说明书中指示调节设定，确保轰击喷射均匀。注意，调节均匀喷射条件之后，需使用 70%乙醇清洗加↓样套管及枪管。

　　2. 操作前需对无〓菌操作台进行清洁和消毒处理工作。(至少紫外线曝光半】小时)

　　3. 在放入无菌操作∩台之前先对枪管、加样套管、目标间隔件和镊子进行消毒处理。

　　4. 需先喷洒浓度为70%的乙醇在GDS-80基因枪主体以及软管组件表面，再将它们放入无菌操作台。

　　5. 组装管筒和样品加ぷ载套管，使GDS-80基因◣枪主体置于无菌操作台内部并连接整个GDS-80系统。

　　6. 将压力调节器设为50psi，并确保气体流╳速约10?15 L/min。

　　7. 在进行轰击前，准备DNA质粒/金粉溶液。(0.5 ug DNA/ 0.148 mg金粉)

　　8. 在一个3或6 cm的目标间隔件辅助下对样品进行轰击，并☉在轰击之后将样品转移到 MS 培养基上。

　　9. 培育样品至少两天的时间↑，然后以GUS染色溶液进行染色，为期一天。

　　10. 在显微镜√下观察结果。

　　结果

　　(a)

　　(b)

　　图1.将GUS基因在3 cm目ζ标间隔件的辅助下以50psi压强导入玉米胚芽。

　　(a)在没有污染的正常条件下 (b)处于被污染的介质中

　　讨论

　　在无菌操作台内操作时，有◤很多方面需要时刻注意，否则可能导致严重污染并∞且影响实验的观察结果(如图1)。如果培养★皿内部被污染，即使在DNA样本没有被污染的情况下，GUS蛋白质含量也将会因为过少而导致无法被发现。

　　污染通常是由以下几卐种情况造成的，适当的注意即能够避免：

　　a.由轰击设备产生的污染■。

　　在无菌操作台※操作GDS-80基因枪时，用户很容易忘记拆开枪管和样本加载套管进行消毒，而只将70%浓度的酒精喷洒在样本加载套管的外表面。这样的消毒并不彻底，因为即使轰〗击原料DNA质粒↙样本是在100%纯酒精中准备的，仍然很难清除那些依附在枪管以≡及样品加载套管上的微生物，这样就使得传递过程中，细菌会被一同推送并扩散到样品上。GDS-80基因枪在植物针对性实验中可以⌒使用一些配件协助实验更好地进行，例如，使用目标间隔件来辅△助培养皿中进行的」组织实验，或使用UTS-10进行愈伤组织细胞实验。所有实验中使用的配件，甚至包括作为支撑样品的配件，都能轻易接触到样品，因此应充◎分将这些部件消毒以防止污染。所有实验用设备部件均可以采㊣　用高压灭菌器在121摄氏度杀菌30分钟，以确保⊙彻底消毒。另一种消毒方法是将枪管与样本加载套管置入70%乙醇溶液中浸ζ　泡20分钟以上，并将其干透后放入↓无菌操作台中。

　　b.来自样本本身的污染。

　　从田地中＠取来的植物样本本身与很多微生物有接△触，如果样本实验前未经消毒将很容易在介质中被污染，因此样本务必在实验前进行消毒。由于样本的特性不同，所进行的消毒方式也々不同。最常用的方法是将①样本浸泡在准备好的溶液中并添加适当比例的漂白剂和Tween-20，一起浸制20分钟以上，然后使用无菌蒸馏水清＠ 洗，并在实验前把样本分散放置在干净的培养皿中晾干。

　　c. 不熟练的操作会导致无菌操作台内的污染。

　　在无菌☉操作台内部进行实验时，绝大部分的人会忽略一些重要环节。在无菌操作台内进行实验◣之前，请确保彻◆底清洗双手并且使用浓度为70%的乙醇进行消毒。一旦进入无菌操作台进行双手操作，请勿在结束实验前将手撤离操作台。如果有将物体移进或者移出无菌操作台的≡需要，请务必∴在返回无菌操作台内部进行操作之前使用浓度为70%的乙醇消↘毒双手。在操作培养皿的时候，请不要将盖板敞开太多，也不要在盖板敞开的情▆况下，让手或者任何物体在其上▓方经过。确保在送其进入无菌操作台之前将移液〇枪头消毒。每次夹取样品之前都要更换移卐液枪头。只可以用镊子处理目标样本，同时也要确保每次操作前用火来消毒镊子，不能让镊子碰到样本以外的任何物品。如果样本掉在桌子上，切勿№将其捡起放回培养基中。确保在将所有的设备和材料∑　放入无菌操作台之前，都已经▃使用正确的方法消过毒。

　　d. 无菌操作台并没有得到很好的维护。

　　根据无菌操作台的设计，操作台内过滤器在使用一段时间后，或者当滤液对微☆生物的作用减弱时应进行更换。请定期更换无菌操作台内的▲过滤器以保持最佳▼的无菌环境。即使无菌操作台得到良好的维护，操作者仍需要在使用前喷洒70%浓度的乙醇溶液来清洁机器内部的操作区域。

　　在进行整体系统操作前，所有的实验器材都必须进♀行严格消毒处理。在操〖作中不允许有任何污染。虽然每个实验室的无菌实验台的标准操作程序(SOP)不同，但其主要目都是相同的，均以防止污染为准。操作者应认真地遵循SOP来操作，并ω　注意我们上面说过的如何避免微生物的污染的几个重要方面。