细胞培养知识(一)

　　1 冷冻管应如何解冻?

　　取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。

　　2 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO?

　　除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞)， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可↑避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

　　3 可否使用与原先培养条件不同之培养基?

　　不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。

　　4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类?

　　不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同◆物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

　　5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是⌒相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使▲用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血∑　清。

　　6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2?或根本没有影响?

　　一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。

　　7 何时须更换培养基?

　　视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。

　　8 培养基中是否须添加抗生素?

　　除于特殊筛选系统中外， 一般∑正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。

　　9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度?应如何处理? 一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于-20 °C，避免反复冷冻解冻造成∮trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会ぷ。

　　10 悬浮性细胞应如何继代处理?

　　一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分★瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶▲， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。

　　11 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速?

　　欲回收动物⊙细胞， 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过『高之转速， 将造成细胞死亡。

　　12 细胞之接种密度为何?

　　依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

　　13 细胞冷冻培养基之成份为何?

　　动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。

　　14 DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何?

　　冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即∞为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4°C， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有↓害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。

　　15 冷冻保存细胞之方法?

　　冷冻保存方法一: 冷冻管①置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。 冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至-80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。

　　16 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?

　　冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞≡则以5x106 cells/ml vial 为宜。

　　17 应如何避々免细胞污染?

　　细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污♀染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环〓境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最ぷ好方法。

　　18 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理?

　　直接灭☉菌后丢弃之。

　　19 支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状?

　　不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。

　　20 支原体污染会对细胞培养有何影响?

　　支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为Ψmycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

　　21 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何←处理?直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。

　　22 CO2 培养箱之水盘如何保持清洁?

　　定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

　　23 为何培养基保存于4 °C 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性?

　　培养基保存于4 °C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养⊙基偏碱时， 可以通入无菌过滤之ΨCO2， 以调整pH 值。

　　24 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同?

　　不同厂牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有【太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著╱之生长差异。

　　25 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形?

　　研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的失误， 造成细胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

　　26 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?

　　研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞¤解冻后， 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞〒。培养温度使用错误。细胞置于-80 °C 太久。

　　27 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖■有裂纹，或瓶盖脱落之原因?

　　冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

　　细胞培养知识(二)

　　无菌操作基本技术

　　1. 实验进行前，无菌室及无菌操作＠ 台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70% ethanol 擦拭无菌操∩作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作∏台，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。

　　2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70% ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。

　　3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污ω染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打◆开后，以手夹住瓶盖☆并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口□　朝上放置桌面。

　　4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。

　　5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。

　　6. 水槽可添↘加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期ζ更换水槽的水。

　　实验用品

　　1. 种类?

　　1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃◆容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。

　　1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸ω　附，培养容器种类有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。

　　1.3. plastic sterile pipet: 1ml, 2ml,5ml, 10ml, 25ml

　　1.4. 塑料离心管: 15ml, 50ml，均有2 种不同∏材质，其中polypropylene (PP) 为不透明材质，polystyrene (PS) 为透明◎材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。

　　1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。

　　1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100ml, 250ml,500ml,1000ml

　　2. 清洗? 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。

　　3. 灭菌?

　　3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，置于oven 中烘干。

　　3.2. 实验用玻璃pasteur pipet 以干热灭菌170℃, 4 小时。

　　3.3. 液体或▲是固体废弃物可用10% hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高压灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟处理。

　　培养基

　　1. 液体ω　培养基贮存于4℃冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水槽¤中温热。

　　2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分◎解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。

　　3. 粉末培养基配制(以1 升为例)：

　　3.1. 细胞培养基通常须添加10% 血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml，pH 为7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有▃影响，且贮存时培养基※的pH 易发生改变。 3.2. 材料：

　　3.2.1. 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要)

　　3.2.2. 粉末培养基

　　3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)

　　3.2.4. 电磁搅拌器

　　3.2.5. 无菌血清瓶

　　3.2.6. 0.1 或0.2 mm无菌↓过滤膜

　　3.2.7. pH meter

　　3.2.8. 真空帮浦

　　3.2.9. CO2 气体

　　3.3. 步骤：

　　3.3.1. 取粉末培养基溶于700ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。

　　3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于200ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。

　　3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH 会升高0.1-0.2。

　　3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。(血清亦」可加入培养基中一起过滤)

　　3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。

　　4. 配制培养基之生长々测试

　　4.1. 材料：

　　4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)

　　4.1.3. methanol

　　4.1.4. glacial acetic acid

　　4.1.5. 10% Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)

　　4.2. 步骤：

　　4.2.1. 以待测试培【养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每个well 接种1 × 102 活细胞，同时作对照组实验。

　　4.2.2. 接种5～7 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。 4.2.3. 去除培」养基，加入1ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸? 3:1)，室温下静置10 min。

　　4.2.4. 去除固定液，水洗二次。

　　4.2.5. 加入1ml 10% Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。

　　4.2.6. 去除染液，水洗二次。

　　4.2.7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。

　　细胞培养知识(三)

　　如何选用特殊细胞系培养基?

　　培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细ξ　胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIM V(12005)培养基(SFM)。

　　L-谷氨酰胺在细▼胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?

　　L-谷氨酰胺在细胞培养∞时是重要的。脱掉¤氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷♀氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

　　GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?

　　GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种㊣　肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷卐氨酰胺几乎完全降解。

　　什么培养基中可以省去加酚红?

　　酚红在培养基◇中被用来作为PH值的指示剂：中性▆时为红色，酸性时为◥黄色，碱性时为▲紫色。研究表明，酚红可以模拟♀固醇类激素的作用，(特ω别是雌激素)。为避免固醇类反应，培养细胞，尤◣其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细□　胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红︼可以模拟固醇类激素的作用，(特别是雌激素)。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 如何⌒用台盼兰计数活细胞? 用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/毫升，在0.1毫升的细胞悬液中加入0.1毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

　　如何消除组织培养的污染?

　　当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或①酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。 高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实◣验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这∩点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时□　尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。 1. 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细●胞传代的浓度。 2. 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔↙中。例如，两性霉素B推荐下列▼浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。 3. 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。4. 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗㊣生素的培养液培养细胞2～3代。 5. 在无抗生素的培养◢基中培养细胞一代。 6. 重复步骤4。 7. 在无抗生素的培养基中培养【4～6代，确定污染是◆否以已被消除。

　　培养基中丙酮酸钠的作用是什么?

　　丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞¤也可以代谢丙酮酸钠。

　　细胞培养知识(四)

　　1.如何选用培★养基?

　　培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基(SFM)。

　　2.为什么要热灭活血清?

　　加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平∴滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

　　3.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?

　　它在溶液中不稳定吗? L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

　　4.GlutaMAX-I是什么?

　　培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定? GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。

　　5.为什么培养基中可以省去加酚红?

　　酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

　　6.如何用台盼兰计数活细胞?

　　用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

　　7.如何消除组织培养的污染?

　　当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

　　1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。

　　2)分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

　　3)每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。

　　4)确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。

　　5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

　　6)重复步骤4。

　　7)在无抗生素的培养基中培养4-6代，确定污染是否以已被消除。

　　8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么?

　　丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

　　9.Hank’s 平衡〖盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么?

　　Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和Earle’s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别? HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平】的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会「变碱，Hanks液在CO2培养箱中会←变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

　　10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别?

　　Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：End-Point Determination of Endotoxin Content噬菌体检验生物化学检测 激素的检测血红蛋白检测Sf9 细胞生长促进及方法学检测

　　11.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是◣什么?

　　二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

　　12.制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率⊙吗?

　　是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100μl OPTI-MEM中，稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基(800μl)。(注意以上是35mm培养皿使用体积)。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。

　　13.我使用SF900 Ⅱ时，细胞生长良ぷ好，但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好?

　　如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作〗用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白ω酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清(少于1%)，让血清给蛋白酶提供作用底物。

　　14.如何检测内毒素(热源)水平?

　　LAL(Limulus Amebocyte Lysate)试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎(Limulus polyphemus)血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统(丝氨酸蛋白酶级联反应系统)，通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，LAL中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的∞鲎(血细胞)裂解物。胎牛血清的内毒素检测√是在Grand Island，按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10稀释样品。稀释样品★沸水育5分钟，以消除抑制剂。(通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。)

　　15.我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗?

　　如果使用固体形式的培养基，需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。

　　16. 20℃下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH值会改变吗?

　　对于普通使用的缓冲液，PH值随温度变化而变◆化。下表◣列出温度改变10℃时，PH值的变化情况例如 20℃下配制PH7.4 Tris缓冲液,40℃时PH值为 7.4-(2x0.310)=6.7817. 室温下(25℃)配制的

　　17.Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少?

　　缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同的PH值。

　　18. 昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少?

　　生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值 6.0-6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最适渗透压是 345-380mOsm

　　19. High Five细胞有任何其它名称吗?

　　High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

　　20.在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少?

　　High Five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。

　　21.High Five细胞用多大的密度冻存?

　　3.0x10E6 cells/ml

　　22.在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么?对我的细胞有害吗?

　　可能是谷氨酰胺沉淀，但是≡更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。

　　23.如何从T25瓶中转移sf9细胞?能用胰蛋白酶消化吗?

　　我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性最小，生ㄨ活力最高。通过使用巴氏德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化〇细胞。胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：1)去除◤培养基。2) 用2ml 1xPBS(足以覆盖细胞表面)洗涤细胞，去除PBS.3) 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好≡覆盖细胞表面)。4) 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。5) 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。(培养基中的FBS终止了胰酶的活性。)6) 离心(1100rpm)沉淀细胞。去除培养基。7) 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。 24.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少? 为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。 25.如何评估ES细胞∑　合格的胎牛血清? 使用D3 ES细胞。这是△一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。相关生长效率分析：当ES细胞以非常低的密度传入包含10%胎牛血清的生长培养基中，检测开始和支▂持ES细胞克隆的能力。细胞毒分析：当以非常低的密度传入包含30%胎牛血清的生长培养基中，检测ES细胞和feeder细胞的生∞长能力。相关形态学和分化分析：检测胎牛血清支持未分化ES细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红，分化的细胞较大，丰满，颜色较浅。所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的，培养基中出现ESGRO会掩盖由胎牛血清所导致的问题。(ESGRO或LIF经常用来保持ES细胞处于未分化状态。)经过培＠养发现，大约8批中有1批可以用来培养ES细胞。

　　26.在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少⊙代?随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗?

　　通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候记数时，都应该检查细胞活力。如果超过95%的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。