1. 从原代组织中分离细胞 将组织块分离(散)成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。

　　从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短，以保持最大的活性。下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。

　　(1)胰蛋白酶 (Trypsin)

　　●在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4 mm小片，通过悬浮在无钙镁的平衡¤盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。

　　●将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的√上清液。加入0.25%溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶(100 mg组织加入1ml 胰蛋白酶)。

　　●在4℃孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进♀去。

　　●移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。

　　●在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用◥无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。

　　●通过无菌不锈钢丝网(100～200 mm)过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。

　　(2)胶原酶 (Collagenase)

　　●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4 mm小片，用Hanks平衡液(HBSS)清洗组织碎片几次。

　　●加入胶原酶(50～200单位/ml，溶解在HBSS中)。

　　●在37℃孵育4到18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率。

　　●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。

　　●通过离心在HBSS中清洗悬液几次。

　　●再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。

　　(3)Dispase

　　●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4 mm小片，用不含钙镁的平衡盐】溶液清洗组织碎片几次。

　　●加入Dispase(0.6～2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液)

　　●在37℃孵育20分钟到几个小时№。

　　●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase。

　　●通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次。

　　●再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。

　　2. 从原培养容器中分离细胞:以下是从基层迅速分离细胞，且保持细∩胞完整性的一般步骤。这一步骤并不意味着对于所有细胞系的广泛应用，每一种系统最佳条件和施用浓度应该根据经验加以确定。

　　●再次培养时检测细胞的活性。

　　●细胞的活率应该超过90%

　　●对于无血清培养基，降低胰蛋白酶使用量。

　　(1) 移弃使用过的细胞培养基。

　　(2)使用不包含有钙镁的平衡盐溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗细胞(看表确定正确的清洗溶液)。在培养瓶对着细胞的一面加入清洗溶液，通过转动培养瓶1到2分钟清洗细胞层，然后去除清洗液。

　　(3) 以2～3 ml/25 cm2的量，加选择的分离液(见表)到培养瓶对着细胞的一面。确保分离液覆盖细胞层。在37℃孵育培养瓶，轻轻摇动培养瓶。通常，在5到15分钟内，细胞就会脱落。细胞分离需要的时间因细胞系不同而有所变化。仔细监测细胞分离过程，避免细胞受损伤。对难于从培养瓶基层分离的细胞系，可以轻轻敲打，以加速分离过程。

　　(4)当细胞完全分离时，垂直放置培养瓶，让细胞流到培养瓶的底部。在培养瓶中加入完全培养基，通过移液管在单●层细胞表面反复吹打来分散细胞。计数并再次培养细胞。

　　(5)对于无血清培养基，加入大豆胰蛋白酶抑制剂。通常使用1∶1(v∶v)0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制剂到胰蛋白酶中将抑制胰蛋白酶活性。