实验目的
了解碱法提取质粒的原理;
掌握碱法提取质粒的方法。
实验原理
质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。
这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
结构的三大要素：
多克隆位点
选择标记(耐药性，LacZ)
独立的复制单位
种类：
质粒
噬菌体
酵母人工染色体(YAC)
反转录病毒载体
表达载体∏等
pBC SK
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T-载体
在碱◤性条件(pH 12.5)下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很◤快复性，离□心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。
用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。
实验仪器、材料与试剂
(一) 仪器
1. 恒温摇床
2. 超净工作台
3. 高压灭菌锅
4. 高速台式离心机
5. 微量取液器
(二) 材料
含pBC KS质粒的大肠杆菌 DH 5α。
含重组质粒的大肠杆菌 DH 5α。
(三) 试剂
1. LB液体培养基(1L)
胰蛋白胨 10g
酵母提取物 5 g
NaCl 10 g
加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去 离子水至总体№积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。
LB固体培养基(1L)
在上述LB液体培养基(1L)中加入琼【脂粉15g。
2. SolutionⅠ
50 mmol/L 葡萄糖
25 mmol/L Tris.?Cl (pH 8.0)
10 mmol/L EDTA (pH 8.0)
高压灭菌后，4℃保存备用。
3. SolutionⅡ(现用↓现配制)
0.2 mol/L NaOH
1% SDS
4. Solution Ⅲ(100 ml)
5mol/L KAc 60 ml
冰醋酸 11.5 ml
水 28.5 ml
配制成的溶液Ⅲ含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸 (pH 4.8)。
5. 氨苄青霉素(Amp)
用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20℃冰箱保存备用。
6. 胰RNA酶
将胰RNA酶(RNA 酶 A)溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
7. 氯仿，乙醇 ，70%乙醇。
实验步骤
质粒的提取
1. 用灭菌的』牙签挑取单菌落放入50ml LB液体培养基(含Amp 0.1 mg/ml )中，37℃振荡培养过夜。
2. 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心1min，去掉卐上清液，重复两次。沉淀悬于200μL SolutionI 中, 涡旋使充分悬浮。
3. 加入300μL SolutionII，混匀(注意动作轻)，冰箱3 ℃放置5min。
4. 加入300μL SolutionIII,混匀(注意动作轻) ，冰箱3 ℃放置5min。
5. 12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新Eppendorf 管中，注意所取体积(约600 μL ) 。
6. 加入等体积氯仿(约600 μL )，混匀(注意动作轻)。12,000rpm，4℃，离心10min，取上清液。
7. 上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20℃沉淀 20~30 min。
8. 12,000 rpm离心15 min。
9. 去上清，沉淀加入500μL 70%乙醇洗涤2次( 12,000 rpm离心3分钟)。
10. 去掉上清(注意沉淀勿丢失)，室温或真空干燥沉淀。
11. 每管中加入25μL无菌水1μL RNase， 37℃溶解质粒DNA。
Biospin 质粒DNA 小量提取试剂盒(实际用)
操作过程
1. 将1～1.5ml 过夜培养的细菌菌液加入1.5ml 离心管中。
2. 于10，000rpm离心30 秒，并弃去上清液。
如有需要，可多次重复步骤1、2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取≡质粒的质量。
3. 加250μl Resuspension Buffer，重悬细菌体沉淀。
重悬后应该没有细菌团块。
4. 加250μl 细胞Lysis Buffer，轻柔颠倒4～6 次。
不要剧烈振动，以防止基因组DNA 被剪切。注意不要让反应持续超过5 分钟。
5. 加350μl Neutralization Buffer，立即轻柔颠倒离心管4～6 次。
溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀。
6. 于13,000rpm离心10 分钟。
如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。
7. 将步骤6 离心后得到的上清液转移到Spin column 内。于6,000rpm离心1 分钟，并弃去接液管内液体。
8. 向Spin column 内加650μl Wash Buffer，于12，000g 离心30～60 秒，并弃去接液管内液体。
9. 重复第8 步一次。
10. 再次于12，000rpm 离心1 分钟，然后将Spin column 转移▂到无菌的1.5ml 离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。
11. 向Spin column 内加20μl Elution Buffer、去离子水或TE 溶液，并于室温静置1 分钟。
可根据实验的实际需要决定洗脱液用量。
12. 于12，000rpm离心1 分钟，1.5ml 离心管内溶液中含有质粒DNA。
13. 提取的质粒DNA 可直∩接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20℃。
实验结果及讨论
碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。
如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。
