磷酸钙- DNA 共沉淀法：

　　核酸以磷∩酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时,可使DNA附在细胞表面,利于细胞吞入摄取,或通过 细胞膜 脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内,进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核中,其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合,在细胞中进行稳定表达,基因转导的频率大约为10-4,这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究.此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的∏方法.

　　1、配液

　　(1)2×HBS 1.63g NaCl

　　1.19g Hepes

　　0.023g Na2PO4.2H2O

　　加水至100ml pH7.1过滤,4℃保存

　　(2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌

　　(3)TE： 0.1mmol/L EDTA

　　1mmol/L Tris-HCL PH8.0

　　(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中,加H2O至10mL过滤除菌4℃保存.

　　(5)G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418,G418浓度为200～ 800mg/L

　　注意：对受体细胞先做≡预试验,选用浓度为在10～14天内能Ψ 杀死细胞50%以上的最低∏浓度.

　　2、操作步骤[方法一]：

　　(1) 供体DNA制备：

　　方法按前介绍的DNA提取法提取,溶于TE中,40mg/L.

　　(2) 受体细胞的培养：

　　研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作㊣　为受体细胞.如小鼠NIH3T3胚 成纤↓维细胞 系等,该细胞有一定自发转化倾向,一般在转染前一天接种细胞,接种密度为2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液,37℃、5%CO2培养,待细胞占50～70%瓶底面积时〓,用于转╲染试验.

　　(3) DNA-磷酸钙沉淀物的制备

　　① 将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液,同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo为1～2mg/L的使用量).

　　② 取500μl上述DNA溶液加入硅化〓试管中,缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混匀30秒.

　　③ 然后立即混旋,室温下静置30分钟,待溶液轻度混浊后,吹打后即用于转染受体细胞.

　　(4) 转染受体细胞

　　① 将处于对数生长◇期已占瓶底50～70%的受体细胞卐,在转染前4小时更换一次新鲜培养基,每瓶5ml(25ml培养瓶).

　　② 吸取0.5mLDNA-磷酸钙沉淀,加入含5mL培养液的细胞瓶中摇匀.

　　③ 置37℃ 5% CO2培养24h或更长,使细︽胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒.

　　④ 更换新鲜培养基,继续培养24小时,诱导转〖染基因的表达.

　　⑤ 更换浓度800mg/L的G418选择培养液进行筛选.同时设有未能转染的对照细胞.

　　⑥ 培养大约3～5天,对照细胞大▓部分死亡,这时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择培养基,每3～4天更换一次选卐择培养基.

　　⑦ 2周后对照 细胞死亡 ,在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现,待其增大后再进行克隆化和扩大培养,可建立转▅化 细胞株 ,并做Ψ 进一步鉴定.

　　本实验要加●入PSV2-neo、DNA与外源DNA共转染受体细胞,这样可使受体细胞获得新霉素(neo)基因的抗药性,这样即使癌基因没有出现明▅显的“转化灶”,也可测出转入的外①源性基因的抗neo的标记.而且⊙还可利用被neo基因导入的受体细胞通过G418选择培养筛选转化的细胞建立细胞株.若以获取“转化灶”为目的,可不加入PSV2-neo DNA只需将从 癌细胞 中提取的 基因组 DNA导入受体细胞即可.