[原理]
在动物胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶性质相似的蛋白水解酶：胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。在胰蛋白酶提取过程中，三者彼此很难分开。需采用合适的方法进一步分离纯化。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH值调至酸性(pH3.0左右)，使大量的酸性蛋白沉←淀出来。经硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶●原和弹性蛋白酶原沉淀。沉淀物经水溶解并调至pH8.0，用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活，同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原也被激活，三种酶原相互作用过程如下：
激活后的酶溶液再进一步分离纯化。
[ 试剂 和器材]
1、 试剂
(1)pH2.5～3.0乙酸化的水溶液
(2)10%(体积分数)乙酸
(3)2mol/L硫酸
(4)固体硫酸铵
(5)无水CaCl 2
(6)结晶胰蛋※白酶
(7)25%乙醇溶液(含0.015mol/LHCl 、0.05mol/LCaCl 2 )
(8)95%(体积分数)乙醇
(9)5mol/L NaOH
(10)丙酮
2、器材
(1)胰脏
(2)组织▲捣碎机
(3) 离心机
(4)磁力搅拌器
(5)透析袋、20目筛网、纱布、水浴锅
(7)布氏漏斗、抽滤瓶、温度计、滴管、玻璃搅棒、纱布、pH试纸等
[方法和步骤]
方法一
1、 胰蛋白酶原的提取
取新鲜胰脏约150g，剥去结缔组织↙和脂肪，取净重100g，切成碎块，在组织●捣碎机中捣碎Ψ，并加入2倍体积预冷的pH2.5～3.0乙酸化≡水溶液，制成匀浆。浆液倒入500mL烧杯中，用10%(体积分数)乙酸调节pH在2.5～3.0之间，在5～10℃下提取6h以上，并间隙轻轻搅拌。用4层纱㊣布过滤，尽量挤出滤液。组织残渣中再加ξ入0.5倍体积(约50mL左右)预冷的pH2.5～3.0乙酸化水溶液再提取一次(放置1～2h)，再用4层纱布过滤。合并两次滤液〓【，用2.5mol/L硫酸调节滤液pH在2.5～3.0之间，4℃放置4h(pH始终保持在2.5～3.0)，使提取液中酸性蛋白沉淀析出。提取液用折叠滤纸于玻璃漏斗中自然过滤，收集滤液，量取体积(约200mL左右)。
滤液中加入粉末状ξ 固体硫酸铵，使溶液达0.75饱和度(每升滤液加492g，5℃)。放置过夜，使胰蛋白酶原完全析出。次日抽滤，弃滤液，压紧并收集滤饼№，即胰蛋白酶原粗品。
2、 胰蛋白酶原的激活
将胰蛋白酶原『粗品称重(湿重)，分次加入10倍体积预冷的 蒸馏 水(按滤饼重量计算)，使滤饼完◇全溶解(一般情况滤饼中硫酸铵含量约占饼重1/4)。用5mol/L NaOH将溶液调至pH8.0，慢慢地搅拌下加入固体无水CaCl2使溶液的Ca2+终浓度达到0.1mol/L(要减去一部分氯化钙与硫酸铵结合生成硫︼酸钙的钙离子)。取出2mL溶液用于测定激活前的蛋白含量及酶活性。原溶液中♂加入5mg结晶胰 蛋白酶 ，轻轻搅拌均匀，25℃放置2～4h，或4℃放置12～16h，使胰 蛋白酶 原活化。每隔1h取样测定胰蛋白酶活性增长情况，直至酶激活速度变慢或停止增长。一般比活可达》到3 500～4 000 BAEE单位/mg。留取2mL溶液用于测定激活后的蛋白质含量和〓酶活性。激活Ψ 酶溶液用2mol/L硫酸调pH至2.5～3.0，滤纸过滤，滤去硫酸钙沉淀，收集滤液，4℃保存备用。
方法二
称取冷冻猪胰脏100g，在2～5℃下解冻，切成小块，用组织捣碎▓机中绞碎成胰浆，在5～10℃存放24h以上，使胰酶自身活化。胰浆中加入25%(质量分数)乙醇溶液250mL(25%乙醇溶液中▅加0.015mol/L HCl 、0.05mol/L CaCl 2 )，捣碎机中捣碎1min。胰浆倒入500mL 烧杯 中，间隙搅拌，温度20℃左右，活化5～6h。每隔1.5h，吸取2mL活化液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性。
活化反应结束后，胰浆3 500 r/min离心20min，将离心后上清液用二层纱布过滤。滤液置250mL 烧杯 中，以过滤清液╱的体积为准，加入粉末↑状硫酸铵，搅拌溶解，使溶液硫酸铵饱和度为20%。放置 6h后，3 500 r/min离心20min，保存上清液待∞用，取沉淀。沉淀分别用适量95%乙醇洗涤过滤，再用丙酮洗涤，过滤。最后将沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶△粗品Ⅰ。
在上」述离心上清液中，加入粉末状硫酸铵，搅拌溶解，使上清液溶液达到55%硫酸铵饱和度，放置 6h后，3 500 r/min离心30min，取离心沉淀，分别用适量95%乙醇、丙酮洗涤，过滤』后将沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品Ⅱ。
