金霉素（Aureomycin）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。1 使用目的：本试剂盒用于饲料、鱼、虾和肉类组织（如鸡、牛肉和猪肉），鸡蛋、蜂蜜、牛奶、血清、尿样、土壤等样本中金霉素（Aureomycin）残留的定量检测。2 实验原理本试剂盒采用竞争ELISA方法，在微孔板包被有金霉素（Aureomycin）偶联抗原，加入金霉素（Aureomycin）标准品或样品，游离金霉素（Aureomycin）与微孔条上预包被的金霉素（Aureomycin）偶联抗原互相竞争□　抗金霉素（Aureomycin）抗体酶标记物，用TMB底物显色，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪△在450nm波长下进行检测，吸光值与样品中金霉素（Aureomycin）含量成反比，通过标准曲线计算样品中金霉素（Aureomycin）的含量。 3 试剂盒组成 3.1 预包被的金霉素（Aureomycin）偶联抗原●的可拆酶标板：1块（12孔×8条）。3.2 金霉素（Aureomycin）标准品：6瓶（1ml/瓶），含量分别是：0ppb, 2.5 ppb,7.5ppb,22.5 ppb,67.5ppb,202.5 ppb3.3抗金霉素（Aureomycin）抗体酶结合物：1瓶（6ml）。3.4显色液A：1瓶（6ml）。3.5显色液B：1瓶（6ml）。3.6终止液：1瓶（6ml），2M硫酸。3.7样本稀释液：1瓶（10×, 6ml），用于样品稀释用。3.8浓缩洗涤液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。3.9说明书一份。 4 需要而未提供的材料4.1 设备4.1.1波长450nm酶标仪。 4.1.2粉碎机。4.1.3量筒。4.1.4振荡器。4.1.5漏斗。4.1.6Whatman No 1或相当的滤纸。4.1.7微量移液器。4.2 试剂4.2.1去离子水或蒸馏水。4.2.2 甲醇。5 贮存5.1 试剂盒贮存于2~8℃，切勿冷冻5.2 未用完的微孔板应该密封干燥保存6 注意事项6.1 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。6.2 不要使用过期试剂盒。6.3 试剂盒使用前，将试剂恢复至室温（25±2℃），建议至少回温「2小时。6.4 标准品中含有四环素，使用时应特别注意，操作时应带手套。6.5 终止液中含有硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。6.6 不同标准█品、样品所用吸头不能混用，否则会影响试验结果。6.7 不同批号试剂盒中的试剂不得混用；不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响实验结果。6.8 稀释样本时必须用本试剂盒中的样本稀释液，否则会影响实验结果6.9 混合试剂时应避免起泡。7 工作液准备7.1金霉素（Aureomycin）标准品溶液：0ppb, 2.5 ppb,7.5ppb,22.5 ppb,67.5ppb,202.5 ppb7.2 浓缩洗涤液：用蒸馏水按1:20(1+19)稀释备用7.3 样本稀释液：用蒸馏水按1:10(1+9)稀释备用7.3 显色剂：已备用，避免∮光线直照7.4 反应〒终止液：已备用8 样品处理：（样品在提取过程中，要严格按说明书操作，提取过程中应准确稀释，否则会出现结果不准确，样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存）一般样品处理8.1取10g粉碎的样品，加 20ml 70%甲醇溶液8.2强力振荡3分钟8.3用Whatman No 1滤纸过滤8.4取100μl处理后的样品，加入400μl样本稀释液8.5取100μl稀释液进行分析动物组织前处理8.6准确称取1±0.05 g匀浆后的组织样品到50 ml的聚苯乙烯离心管中；加入3ml乙腈--丙酮提取溶液，2000rpm剧烈震荡20s后4000r/min以上离心5min8.7取上清液0.8ml在50℃氮气流下吹干8.8加入3.2mL样品稀释液, 750rpm涡旋20s8.9取100?l用于分析 饲料前处理方法8.10准确称取1±0.05 g粉碎饲料样品到50 ml的聚苯乙烯离心管中；加入4ml乙腈，1ml丙酮，2000rpm剧烈震荡20s后4000r/min以上离心3min8.11取上清液0.7ml在50℃氮气流下吹干8.12加入2.8mL样品稀释液,涡旋20s，混匀后取100?l用于分析牛奶前处理方法8.13取1 ml牛奶样品到5 ml聚苯乙烯离心管中；加入4ml样品稀释液，混匀后取100?l用于分析奶粉前处理方法8.14准确称取0.3g奶粉样∏品到7 ml的聚苯乙烯离心管中；加入2ml PBS溶液，2 ml正己烷，震荡混匀8.154000r/min以上离心5min，去除有机层和中间层，取下层溶液100ml到400ml 样品稀释液8.16混匀后取100ml用于分析 9 酶免分析步骤9.1 实验须知9.1.1 实验开始前请将所有试剂于盒外充分恢Ψ 复至室温（25±2℃），时间约2小时。回温至室温（25±2℃）后再取出微孔条，多余的微孔条重新密封立即于2~8℃干燥保存注：一定保证回温充分，否则影响检测的精确度和准确度。9.1.2 使用后请立即将试剂放回2~8℃保存9.1.3 请不要改变分析程序9.1.4 请使用精确的微量移液器9.1.5 操作一旦开始，请不要中断任何程序9.1.6 ELISA结果的可重复性极大程度的取决于操作程序，请严格按照要求操作9.1.7 为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的吸头加样9.1.8 加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面9.2 分析步骤9.2.1 预先进行编号，标记B0、标准「品和样品的位置，推荐进行双孔检测9.2.2 取所需数量的微孔（微孔条可拆），将多余板条重新密封并立即放回2~8℃保存9.2.3 样品稀释液、浓缩洗涤液（20×）稀释成工作液(蒸馏水或去离子水稀释)9.2.4 在B0孔中加入50μl0.0 ppb标准品溶液9.2.5 在各标准孔中加入50μl的标准品溶液9.2.6 在各样品孔中加入50μl样品溶液9.2.7 在所有孔中加入50μl的抗金霉素（Aureomycin）抗体酶结合物9.2.8 轻轻晃动反应板几秒钟。 9.3 37℃温浴30min （温浴过程中不时轻拍反应板，可以减少双孔误差）9.3.1 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板5次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。9.4 反应9.4.1 洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50μl显色液A，再加 50μl显色液B；轻微晃动反应板使之彻底混匀9.4.2 37℃温浴10min9.4.3 每孔中加入50μl终止液，混匀9.4.4 在450nm下检测吸光度，结果在5min内读取。10 结果计算10.1定量分析10.1.1所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除∩以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0—0 ppb标准溶液的平均吸光度值10.1.2以金霉素（Aureomycin）浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为金霉素（Aureomycin）浓度的对数值，求得反对数即为测定液中金霉素（Aureomycin）浓度C（ppb）10.1.3由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释倍数。 10.2 半定量测↘定10.1.1目测半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品吸光度值的高低比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。10.1.2仪器半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品颜色深浅比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。 11 特异性物质 交叉反应金Ψ 霉素（Aureomycin）100%12 试剂盒参数本试剂盒检测下限为2.5ppbB0吸光度最佳值应大于1.0试剂盒吸光度板内误差小于8％，板间误差小于15％。用本说明书提供的组织样本提取方法回收率大于80％。13 标准曲线模式（仅供参考）试剂盒提供的标准曲线范围为2.5 ppb ~202.5 ppb。 14 分析限制本试剂盒检测为阳性的样品应该用另一种↓方法如HPLC或GC/MS加以确证。