大鼠胰岛素自身抗体(IAA)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书? 本试剂盒仅供科研使用。? 本试剂盒用于体外定量检测大鼠血清、血浆及相关液体样本中胰岛素自身抗体(IAA)的含量。? 有效期：6个月? 保存条件：2-8℃实验原理 本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中大鼠胰岛素自身抗体(IAA)水平。用纯化的大鼠胰岛素抗原包被微孔板，制成固相抗体，往包被抗原的微孔中依次加入胰岛素自身抗体(IAA)，再与HRP标记的胰岛素抗原︽体结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的胰岛素自身抗体(IAA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测〓定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠胰岛素自身抗体(IAA)浓度。试剂盒组成 试剂盒组成 96孔配置 保存1 说明书 1份 2 封板膜 2片（96） 3 密封袋 1个 4 酶标包被板 1×96 2-8℃保存5 标准品：135 pmol/L 0.5ml×1瓶 2-8℃保存6 标准品稀释液 1.5ml×1瓶 2-8℃保存7 酶标试剂 6 ml×1瓶 2-8℃保存8 样▲品稀释液 6 ml×1瓶 2-8℃保存9 显色剂A液 6 ml×1瓶 2-8℃保存10 显色剂B液 6 ml×1瓶 2-8℃保存11 终止液 6ml×1瓶 2-8℃保存12 浓缩洗涤液 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存样本处理及要求1. 血清：室温血液◣自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程≡中如有沉淀形成，应该再次离心。3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有№沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4. 细胞培养〒上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有卐沉淀形成↑，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将↓标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻╱备用。6. 标本采集↙后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.7. 不能』检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣⌒根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各√取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各㊣　取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第↓七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为90 pmol/L，60 pmol/L，30 pmol/L，15 pmol/L，7.5 pmol/L）。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样≡品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测①样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶标试剂50ul，空白孔除外。7. 温育：操作同3。8. 洗涤：操作同5。9. 显色：每孔⊙先加入显色剂A50ul，再加入显色剂B50ul，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 10. 终止：每孔加终止液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。注意事项1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未▓用完，板条应装入密封袋中保存。2． 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验∩误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。5． 封板膜只限☆一次性使用，以避免交叉污染。6． 底物请避光保存。7． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8． 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9． 本试剂不同批号组分不得混用。10. 如与ζ英文说明书有异，以英文说明书为准。计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标， 在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释 倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标 准ω　曲线的直线回归方程式，将样品的OD值 代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释 倍数，即为样品的实际浓度。 （此图仅供参考）试剂盒性能1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。2.批内与批间应分别小于9%和15%检测范围： 5 pmol/L -100pmol/L