一、实验原理

　　细胞培养可分为原代培养和传代培养。直接从体□内获取的组织细胞进行首次』培养为原代培养;当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分▅散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。

　　细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能「提高 细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于♂冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水▆分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

　　二、实验方法

　　材料：

　　小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培养皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培养瓶，培养 液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微∞镜，显微镜，计数板，离心机，恒温╲水浴箱，冰箱(4℃、-20℃、-70℃)，液氮罐，冻存管，冻存液，废液缸等。

　　冻存：

　　1.吸取传代后的细胞悬液，离心，去除①培养液，加入冻存液，分装冻存管(冻存管内细胞数目一般为(5～10)×106个/ml，2ml冻存管中一般放1～1.5ml细胞)。

　　2.按步冻存

　　o冷冻保№存方法一：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min;当温度达-25℃以下时，可增至-5～-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。

　　o冷冻保存方法二：冷冻管置于已¤设定程序之程序降温机中每分钟降卐1～3℃至-80℃以下，再放入液氮长期保存。

　　复苏：

　　1.取出冷冻管※，立即放入37℃水浴箱中快速解冻，轻摇冷冻管使其︽在1分钟内全部融化，移入无菌操作台⌒　内。

　　2.打开冻存管︾，将细胞悬液吸到离心管中。

　　3.1000rpm离心10分钟，弃去上清液。

　　4.加适当培养液后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生∩长情况。