大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）含量。实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）水平。用纯化的大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微ξ　孔中依次加入中性粒细胞弹性蛋白酶（NE），再与HRP标记∏的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）抗体结合，形成抗体-抗原-酶◥标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的中√性粒细胞弹性蛋白酶（NE）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）浓度。试剂盒组▃成：试剂盒组↑成 48孔配置 96孔配置 保存说明书 1份 1份 封板膜 2片（48） 2片（96） 密封袋 1个 1个 酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保存标准↓品：27ng/mL 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存标准∏品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存酶∩标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存样品稀▓释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存终止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存浓∞缩洗涤液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存样本▲处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集ξ　上清，保存过程中如出现沉淀，应再☆次离心▓。2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清▂，保存过程中如有沉淀形成，应该再☉次离心。3. 尿液：用↓无菌管收集〓，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时Ψ，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到∑100万/ml左右。通过反复︽冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本卐后，称取重量。加入一定√量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将∩标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后◇一份待检测，其余冷冻备用。6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快●进行实验。若不能◣马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应︼避免反复冻融.7. 不能☆检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标ξ包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后ζ从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四∩孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔ξ　中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第∞五、第六孔中各▅取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释ω　液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准◥品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为18 ng/mL，12 ng/mL ，6ng/mL，3 ng/mL， 1.5 ng/mL）。2.加样：分别设空白※孔（空白对照孔不加样∞品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终↙稀释度为5倍）。加样将→样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动【混匀。3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤》液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。7.温育：操作同3。8.洗涤：操作同5。9.显色：每孔Ψ先加入显色剂A50μl，再←加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时▅蓝色立转黄色）。11.测定：以空白空调零，450nm波长㊣　依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止↙液后15分钟以内进行。注意事项：1．试剂盒▆从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标ζ包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3．各步加样均应使用加△样器，并经常校对其准确性，以避免试验♂误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪ζ　加样。4．请每次测定的同时做①标准曲线，最︼好做复孔。如标本中待◣测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。5．封板膜只限』一次性使用，以避免交叉污染。6．底物请避光保存。7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定◆必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9．本试剂不同ω批号组分不得混用。10. 如与英〓文说明书有异，以英文说明书为准。计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为︽纵坐标， 在∴坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度∞；再乘以稀释 倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标 准∏曲线的直线回归方程式，将样品的OD值 代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释 倍数，即卐为样品的实际浓度。 （此图仅供参考）试剂盒性㊣　能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。2.批内与批见应分别小于9%和15%检测范围： 0.7ng/mL -22ng/mL 保存条件及有效期：1.试剂盒保存▆：；2-8℃。2．有效期：6个月