(1) 显色

显色是ELISA中的最ㄨ后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适ξ当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严【格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。

OPD底物显色一般在室ζ　外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行⊙，显色反应结束时加入终Ψ止液终止反应。OPD产□物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。

TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应↘观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间ㄨ阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显▓色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可】使反应终止「。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间(12-24小时)不褪，是目视判断的良№好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长(450nm)测读吸光值。

(2) 比色

比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正↓确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验▆，需先将板置于标准▓96孔的座架中，才可进行比色。最好在加底物液显色前，先将软板边╲缘剪净，这样，此板就可完全平妥坐入座架中。

比色时应』先以蒸馏水校零点，测读底物孔(未经任何反应仅加底物液的孔)和空白孔(以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔)，以记录本次试验∞的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔⌒　的吸光度，然后进行ω　计算。

比色结果的表达以往通用光密度(oplical density，OD)，现按规定用吸光度(absorbence，A)，两者含义相同。通常的表示■方法是，将吸』收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长▽为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。

(3) 酶标比色仪

酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测※读ELISA结果吸光度的光度计。针对固︾相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数♂的准确性、重复性、精确度和可测范卐围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。举例说，若某◥孔测得的A值为1.083，则该孔相对于空气的真实A值应为1.083±0.01(1.073~1.093)，重复测定数次，其A值均应1.083±0.05(1.078~1.088)在之间。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶㊣　标仪在0.000~2.000，新型▂号的酶标仪上限拓宽达2.900，甚至更高。超出可测上限◤的A值常以"*"或"over"或其它符【号表示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为0.000~2.900，而其线性范围】仅0.000~2.000，这在定量ELISA中制作标准曲△线时应予注意。

酶标仪「不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜々在15~30℃，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。

测读A值时，要选〓用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读＠ 两次，第一←次在最适波长(W1)，第二次在不敏感波长(W2)，两次测定间不移动ELISA板的位置。例如OPD用492nm为W1，630nm为W2，最终测得的A值为两者之差(W1-W2)。双波长式测读♀可减少由容器上的划痕或【指印等造成的光干扰。