鱼瘦素（LEP）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明㊣　书本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定鱼血清，血浆及相关液体样本中瘦素（LEP）的含量。实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鱼瘦素（LEP）水平。用纯化的鱼瘦素（LEP）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入瘦素（LEP），再与HRP标记的瘦素（LEP）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗＠ 涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的瘦素（LEP）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线◇计算样品中鱼瘦素（LEP）浓度。试剂盒组成：试剂盒组成 48孔配置 96孔配置 保存说明书▲ 1份 1份 封板膜 2片（48） 2片（96） 密封袋 1个 1个 酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保存标准品：9μg/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保▓存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存样品稀■释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存卐终止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保︻存浓缩洗涤液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集▂上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离▅心。2. 血浆：应※根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细『收集上清〇，保存过程▲中如有沉淀形成，应该再次离心。3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集①上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照→实行。4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时⊙，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后◥，称取重量。加入ω　一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份♀待检测，其余冷冻备用。6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进⌒行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.7. 不能○检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤：1. 标准品的稀释与加样▓：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一︾孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四︻孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各〗取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第¤七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别∮加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为6μg/L，4μg/L ，2μg/L，1μg/L， 0. 5μg/L）。2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测◥样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4. 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤ㄨ液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。5. 洗涤：小心╳揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。7. 温育：操作同3。8. 洗涤：操作同5。9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻№震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11. 测定：以空♂白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内【进行。注意事项：1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2． 浓洗涤液可能会有结晶→析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3． 各步加样均「应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量↑多，推荐使用排枪加样。4． 请每次测定的▽同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量】过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时▆请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6． 底物请避光保存。7． 严格按照说明『书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8． 所有样品，洗涤液和各种废∑弃物都应按传染物处理。9． 本ω试剂不同批号组分不得混用。10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标， 在坐标纸◥上绘出标准曲线，根△据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以♀稀释 倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标 准曲线的直线回归□　方程式，将样品的OD值 代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释 倍数，即□为样品的实际浓度。 （此图仅供参考）试●剂盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。2.批内与批见应分别小于9%和15%检测范围： 0.3μg/L -8μg/L 保存条件及有效期：1.试剂盒保存：；2-8℃。2．有效期：6个月