1.目的要求
掌握酸性磷酸(酯)酶活性测定的原理和方法。
2.方法原理
酸性磷酸(酯)酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。以对硝基酚磷酸钠作为底物,在酸性磷酸酯酶的作用下,在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚,可用分光光度计进行比色测定。它们在各类种子中普遍存在,且含量较多,在萌发前期,随着种子的萌发进程活性增加,通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。
3.主要实验仪器及材料
干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。
4.掌握要点
掌握常用的测定酸性磷酸(酯)酶活性的方法——对硝基酚磷酸※钠法。
5.实验内容
(1)酶液提取。称取1g样品,用5mL研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆,再用5mL研磨缓冲液冲洗,转移至离心管中,在20000rpm下离心10min。吸出上清液,即为酶粗提液。可放在冰箱中储存备用。
(2)活力测定。取酶液0.1—1mL(视酶含量多少而定),加水至1mL,然后加入缓冲液1mL和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL。空白对照用1mL研磨缓〇冲液代替酶制剂。充分混匀后,放在30℃恒温箱中保温10min,时而摇动。10min后,加入1m0.5mol/LNaOH溶液,充分混合,终止反应,并使对硝Ψ 基酚呈黄色。在400nm波长下测吸光度A。
(3)计算酶活性,以每毫克种子每分钟水解底物的nmol数表示。
酶活性nmol/min.mg=
式中0.019为pH=14时,对硝基酚的μmol吸光系数,即对硝●基酚的浓度为1mol/L时,其A=0.019;
3.1为0.0031×1000,反应混合液的体积为3.1,将μmol化为nmol乘上1000;
V为酶制剂总体积;
V1为每次用酶体积。
在实验中要保持酶制剂处于低温下以免酶活性下降,可在冰箱中提取和保ξ存。