棉花黄萎菌酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书◥本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中棉花黄萎菌含量。实验原理： 本试◢剂盒应用双抗体夹心法测定标本中棉花黄萎菌水平。用纯化的棉花黄萎菌抗体包被微孔板，制成固相抗╲体，往包被单抗的微孔中依次加入棉花黄萎菌，再与HRP标记的棉花黄萎菌抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复╳合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终ξ的黄色。颜色的深浅和样品中的棉花黄萎菌呈正相关。用酶标仪在450nm波长下◣测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中棉花黄萎菌浓度。试剂盒♂组成：试剂盒☆组成 48孔配置 96孔配置 保存说明书 1份 1份 封板膜 2片（48） 2片（96） 密封袋 1个 1个 酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保存标准品：90ng/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存样★品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存『终止液※ 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存浓缩洗涤液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存标本要求： 1．标本采集后尽早进行提→取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进↘行试验，可〓将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测∏含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤：1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设※标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准∑品100μl，然后在第一、第二孔中加标准㊣　品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标↙准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准←品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加△到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔●中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为〓50μl，浓度分别为60 ng/L，40 ng/L ，20 ng/L，10 ng/L，5 ng/L）。2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包〒被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度【为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混ξ　匀。3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4. 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后◇备用。5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶①标试剂50μl，空白孔除外。7. 温育：操作同3。8. 洗涤：操作同5。9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入▓显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立卐转黄色）。11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加◣终止液后15分钟以内↘进行。注意事项：1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟※后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2． 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时↑可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确▅性，以避免试验误差。一次加■样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4． 请每次测定的同时做标准曲线，最▃好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一①定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污⌒　染。6． 底物请避光保存。7． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必ω　须以酶标仪读数为准.8． 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9． 本试剂不同批号组分不得混用。10. 如与英文说明书♂有异，以英文说明书为准。计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐ζ　标， 在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线○查出相应的浓度；再乘以稀释 倍数；或用标准物的浓度与OD值计算〗出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值 代入方程式，计︾算出样品浓度，再乘以稀释 倍数，即为样品的实际浓度。 （此图〗仅供参考）试剂盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。2.批内与批◥见应分别小于9%和11%检测范围： 1 ng/L -70 ng/L 保存条︽件及有效期：1.试剂盒保存：；2-8℃。2．有效期：6个月