植物丙二醛（MDA）酶联◥免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅ㄨ供研究使用 目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及相关液体▆样本中丙二醛（MDA）的含量。实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中丙二醛（MDA）水平。用纯化的丙二醛（MDA）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被△单抗的微孔中依次加入丙二醛（MDA），再与HRP标记的丙二◥醛（MDA）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过◢彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成⌒　蓝色，并在酸的作用下转化成最¤终的黄色。颜色的深浅和样品中的丙二醛（MDA）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中丙二醛╳（MDA）浓度。试剂卐盒组成：试剂盒组成 48孔配置 96孔配置 保ζ存说明书 1份 1份 封板膜 2片（48） 2片（96） 密封袋 1个 1个 酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保存标准品：13.5mmol/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存样ㄨ品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存显色♂剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保※存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存≡终止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存浓◥缩洗涤液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存样本处理及要求：1. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管∏收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔♂细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞Ψ悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形→成，应再次㊣　离心。2. 组织标本：切割↙标本后，称取重量。加入一定量的▂PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用ㄨ。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份】待检测，其余冷△冻备用。3. 标本采集后尽早】进行提取，提取按「相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反々复冻融.4. 不能○检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤1. 标准品的稀释＠ 与加样：在酶标包⊙被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中↓各取100μl分别加♀到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔〗分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第々七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加∞标准品稀释液50μl，混匀︻后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀＠ 释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为9mmol/L，6 mmol/L，3 mmol/L，1.5mmol/L， 0.75 mmol/L）。2. 加样：分别☉设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标∮试剂，其余各步操作相◣同）、待测◆样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终№稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量※不触及孔壁，轻轻晃动混●匀。3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4. 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液≡用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤▅液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶标试▓剂50μl，空白孔▲除外。7. 温育：操作同3。8. 洗涤：操作同5。9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色卐剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11. 测定：以空』白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸①光度（OD值）。 测定→应在加终止液后15分钟以内进∑　行。注意事项：1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2． 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤▓时不影响结果。3． 各步加样均应使用加♀样器，并经常校对△其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4． 请每次测定的同时做标▽准曲线，最好做复♀孔。如标〖本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一↘孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6． 底ζ　物请避光保存。7． 严格按照说明书的操作进行，试验结〗果判定必须以酶标仪读数为准.8． 所有样品，洗涤【液和各种废弃物都应按传染物处理。9． 本试剂不同批号组分不得混用。10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为◥纵坐标， 在坐∮标纸上绘出标准曲线，根据样品○的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释 倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值 代入方程【式，计↑算出样品浓度，再乘以稀释 倍数，即∮为样品的实际浓度。 （此图仅供参考）试剂盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。2.批内与批见应分别小于9%和15%检测范围： 0.4 mmol/L -10 mmol/L 保存条件及有效期∩：1.试剂盒保ㄨ存：；2-8℃。2．有效期：6个月