RT-PCR原理与实验操作步骤

　　一、知识背景：

　　1、基因表达：DNA RNA Protein

　　单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA(每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白)共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。

　　2、PCR技术(olymerasechain reaction)：即聚合酶链式反应。

　　在模板、引物和四种▓脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：

　　A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA;

　　B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。

　　C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2+存在下，退火引○物沿53方向延伸。

　　以上三步为一个循环，如此反复。

　　3、逆转录酶和RT-PCR

　　逆转录酶(reverse transcriptase)是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：

　　1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链;

　　2、Rnase水解活性：水解RNANA杂合体中的RNA;

　　3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.

　　二、RT-PCR的准备：

　　1、引物的设计及其原则：

　　1)引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存▆在的内含子。

　　2)引物设计☆原则的把握：引物设计原则包括

　　a、引物长度:一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。

　　b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布◣，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单①一碱基。GC含量(Tm值)：40%～60%，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。

　　c、 3端要求：3端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是A时错配№的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的∑3端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。

　　d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。

　　e、引物之间的二级结构：两引物※之间不应有多于4个连续碱基互补，3端不应超过2个。

　　f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。

　　g、5端无严格限制：5末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳︾定。还可以进行特异修饰(标记、酶切位点等)等等。

　　根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。

　　2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过0.1%DEPC水浸泡处理，除去RNA酶，防止操作过々程中RNA降解。然后经高压灭活(灭菌和灭活DEPC)。

　　3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC处理并高压的水。

　　三、RNA的提取方法：

　　RT-PCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯ξ　度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此⊙在提取RNA时，应尽量创造一个◥无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA 酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯(DEPC)去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。

　　实验操作步骤

　　一、实验←器具与材料：

　　1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

　　2、吸头：1ml、200μl、20μl

　　3、匀浆管：5ml

　　4、吸头台：放置1ml吸头的▓一个，放置20μl吸头的一个

　　5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl

　　6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶(广口，带盖)

　　1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇)

　　7、量筒：50ml、250ml、500ml

　　8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml

　　9、试管架：5ml、1.5ml、20μl