器材与试剂

　　干粉型培养↓基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等

　　具体步骤

　　1、水：

　　细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净Ψ水.

　　2、PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：

　　主要用≡于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗

　　溶解定容：将药品(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4%26middot;H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g )倒入盛有双¤蒸水的烧杯中，玻〒璃棒搅动，充分溶解，然后◇把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制№的PBS溶液。用HCl或NaOH调PH到7.4。

　　移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意◣高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充︼蒸发掉的水份。

　　3、胰蛋白酶溶液：

　　胰蛋白☆酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同⌒的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作◣用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用√胰酶时，应ω把握好浓度、温◣度和时间，以免消化过度造成细∩胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降♂低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

　　称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液▅浓度为0.25%，用电★子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸ω　水(若¤用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。

　　用注射滤器抽滤⊙消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

　　4、0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液

　　称取胰蛋白酶粉末■(1：250) 0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔滤膜过滤╳除菌，分装，于-20℃保存。

　　5、青、链霉素溶液：

　　所用∞纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。 具〓体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。 分装于-20℃保存。使用时↑溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。

　　6、RPMI1640：

　　溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积→2/3的双蒸水≡中,并用双蒸】水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一♀并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉▲素液各0.5ml, 使青链霉素的浓△度最终各为100单位/ml。然后用二氧化碳或碳酸氢钠调」PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。

　　安装蔡式滤器：安装时先装←好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈≡钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。

　　抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台∑　内过滤。

　　分装：将过滤好的培养液分ξ　装入小瓶内置于4℃冰箱内︽待用。

　　使用●前要向100ml培养》液中加入█1ml谷氨酰胺溶√液(4℃时两周有效)。

　　7、血清的灭活：

　　细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后，再经过抽滤方可加入△培养基中使用。

　　8、HEPES溶液：

　　HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N%26rsquo;-a-hydroxythylpiperazine-N%26rsquo;- ethanesulfanic acid )。对细胞◇无毒性作用。它是一〒种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。

　　1mol/L HEPE缓冲液配制①方法如下：

　　准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。0.22um微孔◣滤膜过滤除菌，分装后4℃保存。

　　注意：因为现在市ξ　售HEPES为约10g包装的□　小瓶，所以可根■据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全(20ml)加入1L培养液中，或者每100ml培养液↑中加入2ml即可。

　　9、谷氨酰胺：

　　合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非◥常重要，细胞需要◣谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺ω缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补◆加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶♂液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50%，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养∴液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储∞存2周以上时，应重新加入原来↘的谷氨酰胺。

　　一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养□　液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨◣酰胺溶液【。

　　10、肝素溶液的配→制：

　　含有肝素Ψ 的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温⌒　度为-- ℃ 。使用时，向100ml培养液中加入1ml(精▃确可加入0.9ml)即可。

　　11、Ⅰ型胶原酶：

　　0.1%Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一◥样配制和消毒灭≡菌。注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗】粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。

　　12、明胶溶液：

　　因为明胶难于过∏滤，所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意╱无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克(配成100ml溶液)%26mdash;即解Ψ决无菌分装药品的问题。其次『要注意即使是01.的溶液，明胶也难∞溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌操作分装入50ml小瓶中，4℃保存。

　　13、Hanks液：

　　称取KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4.H2O 0.06g，加H2O至 1000ml

　　注：Hanks液可以高压灭菌。分装于4℃下保存。

　　14、D-hanks液：

　　1液：NaCL:8.00g/L，KCL : 0.04g/L，Na2HPO4.2H2O:0.06g/L，KH2PO4:0.06g/L，配500毫升;

　　2液：NaHCO3：0.35g/L，配100毫升;

　　3液：酚红：0.02g，用数滴NaHCO3溶解酚红

　　将2，3液移入1液中。定容到1000毫升 PH值是7.4左右。分装于4℃下保存。

　　15、Giemsa染液：

　　称Giemsa粉末0.5克，加几滴甘油研磨，再〗加入甘油(使加入的甘油总↙量为33ml)。56℃中保温90~120分钟。加入33ml甲醇，置棕色瓶中ζ　保存，此为Giemsa原液。 使用时按要求用PBS稀释。一般稀释10倍。