(1)在225mL的Fraser基础肉汤中分别加入2.25mL无菌氯化锂溶液、0J3mL尤 菌萘啶酮酸钠盐溶液、1.12mL无菌吖啶黄溶液和2.25mL无菌柠檬酸铁铵溶液(详见附 录1中培养基及其无菌添加物)。混合后制成50%的Frascr?肉汤，加人样品后置于30C 培养Mh,进行初增歯。

　　(2) ①将一环增菌培养物划线于牛津琼脂上，另取一环接种于PALCAM琼脂上Q 平板在35t：或37T：培养48h(牛津琼脂平板在需氧条件下培养，PALCAM琼脂平板在第 10.1中★描述的微生物需氧条件下培养)。

　　②将0, lmL增菌肉汤转接到装有10mLFreser基础肉扬的试管中，置于351：或 37芄培养48h，进行二次增菌。

　　(3) 按(2)①中的方法转接二次增菌液于牛津琼脂平板和PALCAM平板h。

　　李斯特菌属快速筛选试验

　　使用适当的ELISA试剂盒可以对21. 9. 2. 2介绍的初次和二次增菌液〓进行快速检 测，从而对单核细胞增生李斯特菌进行快速筛(如TECRA李斯特菌可视免疫测定法)。

　　李斯特菌的鉴定和验证

　　(1) 李斯特菌能水解七叶苷，除格氏李斯特菌外，其他李斯特菌均不能分≡解甘露醇产酸。在牛津琼脂平板上，李斯特菌菌落直径为2?3mm，带有黑褐色或黑色晕轮(七叶苷 水解所形成)，菌落的中〇心经常是下凹的;在PALCAM琼脂匕李斯特菌菌落直径为 1.5?lnm,绿色并带有黑色的晕轮(或菌落▲中心为黑色)。

　　(2) 验证时，挑取5个典型的菌落，每个菌落划线接种到胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂 (TSYEA)上，置于MT：或37T：需氧培养24?48h,分离平板上的单个菌落以确保菌株的 纯度。

　　(3) 检查TSYEA平板上●生氏的单个菌落,使用亨利描述的菌落特征进行分离(见 3.4. l)o亨利认为李斯特菌在TYS平板上生成细小的、半透明的菌落，菌落呈蓝色＠、蓝绿 色或蓝灰色，菌落表面为细小的颗粒状,类似于粗糙的磨砂玻璃。

　　从TSYES平板上挑取一个单个的菌落，分别接种于胰蛋白胨大豆酵母浸膏肉汤 (TSYEB)试管和胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂(TSYEA)斜面上，25C培养18?24h。

　　(4)①ffl lSYEK肉汤培养物进行菌体运动试验和革兰氏染色。李斯特菌属呈翻ξ　筋斗运动，注意与振荡培养后非致病性李斯特菌的快速直线运动进行区别。李斯特菌为 小的、革兰氏阳性的、无孢子的短杆菌。

　　②用TSYEB斜而t：的生长物进行过氧♀化氢酶和氧化酶试验。李斯特菌过氧化氢 酶试验◆阳性，氧化酶试验阴性o

　　③用TSYEB培养物接种下列培养基，进行验证和鉴定试验：

　　a. 接种D-葡萄糖、D-水杨苷、L-鼠李糖、D-木糖发酵肉汤(含有溴甲酚紫;见附录1)，置35T：或371：培养冗，每天检︼查产酸的情况(生化管由紫色变为黄色)。

　　b. 接种硝酸盐蛋白胨水，检查硝酸盐的产生情况。在35℃或37℃培 养5d。

　　c. 使用金黄色葡萄球菌和马红球菌进行CAMP试验(见11,5.3)。在35℃或37℃ 培养24h。

　　可选用API李斯特菌试剂》盒(HoMMeux)。Mdauchlin发现该试剂盒能够很好地鉴 定和区分不同的李斯特菌种。

　　结果

　　李斯特菌均为革兰氏阳性、小而纤细的杆状菌，过氧化氡酶试验呈阳性，氧化酶试验 呈阴性，能分解D-葡萄糖和D-水杨苷产酸，能进行翻筋斗状运▃动。