1引言

　　细菌感染威胁着人类的生存。1928年Flemming发现了青霉素,1941用于临床,细菌性疾病的治疗从此进入了◤抗生素时代。抗生素这一“神奇的药物”曾使人类有效控制了许多可怕的细菌感染性疾病,发病率和死亡率明显下降。然而进入20世纪80年代,细菌感染并不因为抗菌药物的广泛使用而减少,而是出现了更多的细菌感染;更令人担忧的是,越来越多的细菌产生了耐药性,甚至多重耐药性,变得愈加难以对付,成为人类健康事业面临的严重问题之一。

　　2细菌耐药性

　　耐药性(drug resistance)是指细菌对药物所具有的︼相对的抵抗力。耐药性的程度依↓该药对细菌的最小抑菌浓度(MIC)表示。

　　3细菌耐药的基因机制

　　根▆据遗传特性，将细←菌耐药性分为两类

　　3.1固有性耐⌒药

　　来源于该细菌本身染色体上的耐药基因,代代相传,具有典型的种属特异性。

　　3.2获得性耐药

　　由于细菌在生长繁殖过程中，其DNA发生改变而使其形成获得了耐药性

　　4.细菌耐药性试验必要性

　　细菌〗耐药性监测对准确掌握细菌对抗菌药物的耐药动向和耐药性变迁，并指导临床合理用药具有重要的意义。近◣年来抗菌药物的广泛应用，引起了耐药菌株的大量产生。但新的』抗感染药品问世速度远赶不上细菌变异产◆生的耐药性速度。还有新发传染病及其病原体的不断涌现都说明了细菌耐药性试验的重要性。

　　5.耐药性试验原理

　　测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用的方法称为药物敏感性试验，简称药敏试验。

　　6.常规药敏试验的选药原则

　　(1)选择原则应考虑到药物临床疗效、耐药菌◢株流行情况、预★防耐药菌株产生和经济的综合因素，最︼终目的是达到控制感染。

　　(2)所选药物应包含于本单位的处方手册中。

　　(3)结合所在医疗机构¤的类型、规模及病人★的构成情况。

　　7.常规抗生素种类

　　8.细菌耐药性√实验方法种类

　　8.1纸ζ片扩散法

　　含有定量抗菌药物的纸片〓贴在已接种Ψ 测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最ω　低抑菌浓度(MIC)呈负相关，即抑菌≡圈愈大，MIC愈小。

　　8.2 E-test法

　　E试条是一条 5mm×50mm的无孔试剂载体，一面固定◥有预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称♂抑制浓度(IC)，它与MIC呈高度相关。

　　8.3稀释法

　　以一定浓度的抗菌药物与含有被试■菌株的培养基进行一系列不同倍数稀释(通常为双倍Ψ稀释)，经培养后观察最低抑ㄨ菌浓度。包括肉汤√稀释法、微量肉汤稀释法和琼脂稀释法〓。

　　8.3.1琼脂稀释法

　　琼脂选择法是将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同浓度药物平板，使用多头接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼∑　脂平板所含药物浓度测得MIC。结果判断↙将平板置于暗色、无反光表面上判断试验终点▂，以抑制细菌生长的药物稀释度为终点浓度(磺胺可见少许散在细菌生长)。

　　试验菌的结果报告可用MIC(μg/mL)或用敏感(S)、中介(I)和耐药(R)报告。

　　“敏感”即表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制;“耐药”即表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无效;“中介”者提示该细菌对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株，使用高于正常给药量有疗＠效。

　　8.3.2实验步骤举例

　　乌梅对308株临床菌△株的抑菌效果

　　(1)药液稀释

　　排列无菌试管10只,于2～10 只管中加无菌蒸馏水10 mL,取50%(1∶2)乌梅「水煎液20 mL,于第一管加入10 mL,第2 管加入10 mL,于第2 管混Ψ合后取出10 mL,加入第3 管,再混合后取10 mL 放入第4 管,如此连续稀释至第9 管取出10 mL 弃掉。第10 管只有无菌蒸馏水作对照。这样1～9管中含有不同浓度药液各10 mL。

　　(2)含药平板制备

　　将已溶化的无菌M-H 琼脂900 mL 分装于10瓶,每瓶90mL,将第1管含10 mL 50%的乌梅水煎液放入含90mL 培养基的瓶中,混合后倾注4个平板,每个平ξ　板含25 mL 含药琼脂,第2管以后的平板制备同︽第1管,凝固后⊙备用。这样第1组的琼脂平板实际含乌梅5%(1∶20),第2 组为1∶40,第3 组为1∶80。含药培养基的药物浓度计算：将一定量(50 mL 或100 mL)、一定比例(1∶2 或1∶4)的原药材水煎液于37 ℃温箱中烘干,称重,求出每1 mL 水煎液的实际重量,就可算出每1 mL 培养基中水煎药液干重量。如每100 mL 50%乌梅煎液干重为11500 mg,第1组每100 mL含药培♀养基含有煎液10 mL,那么每1 mL 培养基含煎液干重则为：

　　所以第1组含药培养基实际含煎剂干重为11.5 mg/mL,因倍量稀释ω,故第2组含药培养基为第1组数被2除即可。乌梅水煎∩剂即：1∶20=11.5 mg/mL,1∶40=5.75 mg/mL,1∶80=2.88 mg/mL。

　　(3)菌液制备

　　将金黄色葡萄球菌等新鲜培养物(菌落)制成菌液,浓度相当于0.5麦氏比浊管。

　　(4)指标检测

　　用多点接种仪分别吸取各种菌液并将其点种于含不同药物浓度琼脂平板上。于35 ℃培养18～24 h,观察最低抑菌浓度

　　8.3.3琼脂稀释法优缺点

　　9细胞＠ 多点接种仪

　　9.1选购多点细胞接种仪的必要性

　　根据现有大量的具有强耐药性细菌的出现，被测试的药物种类以及其浓度范围都再不断的扩大，这都加重了实验人员的工作量，这也是琼脂稀释法最大的缺点，另外传统的接种方法，接种效果较∮差，准确↑性和重复性都很低。

　　9.2仪器介绍

　　我公司自主研发◣的HMI-60型多点种仪为细菌耐药性实验量身打造的◆仪器，可以在9秒钟内自动进行并完成接种，且一次性可进行多种药物及其不同浓度的接种试验。打破了传统人工接种模式，采用全自动机械接种，使接种过程简单、快速，准确。

　　9.3主要特点

　　l 接种棒使用经特殊处理的不锈钢制成，由于专门的结构设计和特殊加工，消除了接种棒的疏水性并防止了采样时菌液滴落。

　　l 具有∴位置判定针，培养皿上的菌落位置很容易▃判定，灭菌→处理方法简单。

　　l 接种速度≡极快，减轻工作强度并避免操作误差。

　　l 采菌液量准确重现性高，可靠性高的检测手段，采菌量准确确保所有接种棒在培养皿上成功接种。

　　l 操作简单快速接种速度快且可调，实现了快速检测菌液稀释的简易操作，减轻工作强度并避免操作误差。

　　l 独特的可调速旋转式样品托盘可实现自动■定位无需操作只需要更换样品即可完成接种，极大的缩短了操作时间，满足卐了实验室自动化的要求。

　　l 一次性可接种60种药物

　　9.4技术参数

　　9.5采购指南

　　HMI系列多点接种仪根据接种针数目不同分为HMI-24、 HMI-60和HMI-96.其中HMI-24的接种菌液量为3µL，而其它两种均为1µL，可根据实验中配置系列药物浓度的多少进行选择。

　　9.6与传→统接种方式对比优势

　　克服了传统细菌接种方法的∑　诸多缺点，如由于接种环结构以及每个接种环之间的差异而导致采菌液量不准确和由于重复性差所↙导致的裁定药物抗菌浓▃度的不准确等缺点。

　　9.7配套装置指南

　　标配：24位接种架(含24支接种棒，1支位置针，24位样本定位盒);60位接种架(含60支接种棒，1支位置针，60位样本定位盒);选配：96位接种架(含96支接种棒，96位样本定位盒)。

　　9.8已使用客户

　　上海市疾控中心、上海交通大学、湖南食品和药品检验所等。

　　9.9应用领域

　　主要∏用于细菌耐药性实验。广泛应用⌒于药物检测，药品生产、药物研发、疾＠病防控等医药领域。

　　9.10琼脂稀释法举╱例

　　(1)《阿莫西林-双氯西林的体外抗菌作用研究》

　　在对阿莫西林-双氯西林的体外」抗菌作用研究中，收集临床分离菌按CL SI/ NCCLS推荐的琼脂对倍稀释法测定阿莫西林-双氯西林的最低抑菌浓度,并与相关抗菌药物进行比较。MIC的测定方法为按 NCCLS2005 年版推荐的琼◎脂对倍稀释法测定9 种抗菌药的最低抑♀菌浓度。抗菌药的保存〖液和工作液配置均按CL SI/NCCLS 2005年版的描述进行。药物浓度从128～0.06 mg/L共12个㊣　对倍稀释度，细菌的接种菌ξ　量为104CFU/点。使用多点接种器接种35℃培养16～18h。

　　(2)《2002-2003年中国革兰阴性细菌耐药性监测研究》

　　在对2002-2003年中国革兰阴性细菌耐药性监测研究中，采用国际标准平皿二倍稀释法进行体外敏感试验,测得MIC50、MIC90表示抗菌药物的抗菌活性。最低抑菌浓度(MIC)测定:用标准琼脂二倍稀释法测定MIC，根据不同菌种选择适宜培养基。用多点接种〗仪定量接种细菌，根据所♀测每株菌 MIC值，计算 MIC50与 MIC90，并按 NC CLS 2002 规定】的临界浓度，判定每株菌对抗菌药物的敏感度，求出各类细菌对所测定的各种抗菌药物的R %、I%和S%。

　　(3)《利奈ω唑胺对万古霉素敏感及耐药屎肠球菌的抗菌活性》

　　在对利奈唑胺对万古霉素敏感及耐药屎肠球菌的抗菌活性研究中，多重的PCR 法鉴定屎肠球菌万古霉素耐药基因类型，平皿二倍稀释法测定利奈唑胺等11种抗菌药物MIC值。采用标准∮平皿二倍稀释法。被试菌悬液用多点接种仪接种，每点接种量为104CFU/mL。按照CLSI判定细菌对各◣种抗菌药物的敏感、中介和耐药率，其中高浓度庆︼大霉素和高浓度链霉素敏感性的判断标准为：庆大霉素≤500mg/L为敏感，>500mg/为耐药;链霉素≤2000mg/L为敏感，>2000mg/L为耐药。

　　(4)《肠杆菌科细菌质粒介导的喹诺酮耐药机制》

　　中国九家教学医院肠杆菌科细菌质粒介导的喹诺酮耐药机制研究中，究质粒介导的喹喏酮类的耐药基因qnr和缸aac(6’)-lb-cr在我国肠杆菌科临床株中的分布状况。其方法主要【分为qur筛选、aac(6’)-lb-cr的检测和质粒接合实验，其中在在筛↑选平皿上生长的菌落同时采用细胞接种仪接种至含及不含■环丙沙星(0.05µg/mL)的M-H平皿，以〓了解喹诺酮类耐药是否同时转移。

　　(5)《乌梅对308株临床菌株的】抑菌效果》

　　在对乌梅对308株临床菌株的抑菌效果研究中，采用琼脂稀释法对乌梅进行308株临床菌株的抑菌活性检测，采用多点接种仪进行指标检测，具体步骤为用多点接种仪分别吸取各种菌液并将其点钟于含不同药物浓度琼脂板上。于35℃培养18-24h,观察最低抑菌浓度(MIC)，并统计出MIC50和MIC90的药物浓度和累积抑№菌百分率。

　　(6)《苦参、黄芩、乌∞梅对金黄色葡萄球菌、大肠㊣　埃希菌和白假丝酵母菌抗菌活性研究》

　　在对苦参、黄芩、乌梅对金◤黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白假丝酵母菌抗菌活性的研究中，采用M-H琼脂连续稀释法做抗菌作用测定，测出各中药的最小抑菌浓度。在进行MIC测定时使用多点接种仪分别吸取各种受试菌菌液并在15min内将其点种于含不同药物的琼脂板上，于37℃在培养箱中培养18-24h，观察含药▆平板的菌落生长情况，根据含药平板的菌落抑制数，以平板内细菌全部被抑的药物最卐低浓度作为对该〇菌株的最小抑菌浓度即MIC值。

　　10稀释法举例

葡萄球菌属液体稀释♀法、琼脂稀释法

试验条件
培养基	肉汤稀释法：CAMHB；2％NaCL+CAMHB 用于检测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林； 琼脂稀释法：Mueller-Hinton琼脂；2％NaCL+MHA用于检测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林
接种物	直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。
孵育	35±2℃；空气；16－18 小时；测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林和万古霉素需24 小时。试验温度超过35℃不能检测MRS。
推荐的质◆控菌株	金黄色葡萄球菌ATCC29213；大肠埃希菌ATCC 35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺抑制剂↙纸片用）；金黄色葡萄球菌ATCCBAA-977 和金黄色葡→萄球菌ATCCBAA-976（用于克林霉素诱导试验质量评估）

试验条件
培养基	Mueller-Hinton琼脂+5%羊血
接种物	生长法或直接菌☆落悬液法，相当于2麦氏标准。
孵育	35℃±2℃；微需氧；3天
推荐的质◎控菌株	幽门螺杆菌ATCC43504

试验条件
培养基	Mueller-Hinton琼脂，CAMHB,MHA
接种物	生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。
孵育	35℃±2℃；空气；16-18小时
推荐的〒质控菌株	大肠埃希菌ATCC25922

试验条件
培养基	含5%绵羊血的Mueller-Hinton 琼脂；CAMHB+2~5%融解的马血；MHA+5％脱纤维羊血
接种物	直接菌落悬液法，相当于0.5 麦氏标准（纸片扩散法）；来自20-24小时CO2环境巧克力平板的直接菌落悬液法，相当于0.5 麦氏标准（液体稀释法、琼脂稀释法）。
孵育	35℃±2℃；5%CO2；20-24 小时
推荐的质控菌株	肺炎链球菌ATCC49619，5%CO2 环境；大肠埃希菌ATCC25922（在空气或5%CO2 环境）用于环丙〗沙星、萘啶酸和米诺环素监控

试验条件
培养基	Mueller-Hinton琼脂，CAMHB,MHA
接种物	生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。
孵育	35℃±2℃；空气；16-18小时；测万古霉素需24小时
推荐的质控菌株	金黄色葡萄球菌ATCC25923(Mueller-Hinton琼脂);粪肠球菌ATCC29212