材料和试剂
(1)酶标板
(2)酶标仪
(3)0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)
(4)1%BSA
(5)HRP标记的抗M13噬菌体多抗
(6)2mol/L H2SO4
【操作步骤】
(1)将抗原用PBS或0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)稀释至10μg/ml;
(2)对于要检测的每个克隆,至少包被2个孔,每孔用200μl稀释抗原。同时包被阴性对照抗原。此外,包被阳性对照抗原,阳性对照抗原用anti-M13抗体;
(3)室温包被1～2h,最好于4℃过夜包被,甩掉孔中液体,倒置于纸巾上空干。
(4)每◢孔中用至少200μl 1%BSA封闭,37℃1h。去掉液体后空干。
(5)将重组噬菌体事先用等体积的封闭液于室温下封闭15min～30min,以封闭各种蛋白质之间的非特异性结合位点。
以M13噬菌体作为阳性对照噬菌体,也按上述步骤操作。
(6)在每个包被抗原孔中,加入稀释的重组噬菌ξ体悬液200μl,37℃ 1～2h。在包被了阳性对照抗原的孔中,加入200μl阳性对照噬菌体。
(7)去掉孔中液体,倒置于纸巾上。将板浸入PBS/0.5% Tween20(PBST)中,振荡赶走气泡,将板取出。重复洗涤5遍。
(8)将板倒置于纸巾上,去掉所有液体。
(9)将HRP酶标的Anti-M13抗体用封闭缓冲液稀释至合适浓度。
(10)在每孔中加入200μl HRP/Anti-M13稀释液。
(11)37℃温育1h。按前述方法洗涤6次。
(12)每21ml 1×ABTS底物溶★液中加入36μl 30% H2O2。在每孔中加入200μl。
(13)置室温20～60min,直至出现适中的颜色反应。加入2mol/L H2SO4终止反应。
(14)于415nm波长下用酶标『仪读出光吸收值。良好的数据中,噬菌体抗体与筛选抗原的吸收值应当比阴性对照抗原的吸收值高2～3倍。
