酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
(1)戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，它可█以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一『步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混】合物中，反应后即得酶标记抗体。
ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效(结合率达60%-70%)和重复性好等优点。缺点是交联反ξ应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也ぷ不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在︼两步法中，先将酶与戊二醛╳作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用□ 而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结》合的，较一步法的酶√结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但∩其偶联的有效率较一步法低。
(2)过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分◤子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成∴Schiff氏碱而结▅合。酶标记物按★克分子比例联结，其最佳比例为：酶/抗体=1-2/1。此¤法简便有效，一般认为是HRP最可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验╱结果不易重演。
按以上方法制备的酶结合物一般都■混有未结合物的酶和抗『体。理论上，结合物中混有∞的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并不影响最终的显色。但游离的抗体〗则不同，它会与酶标抗体竞争⌒ 相应的固相抗原，从而减少了→结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯≡化，去除游离的酶和抗体后▓用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的∏游离酶，但相当数量的游离抗△体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或Ψ分子筛分离更为可取，高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分：游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果，但费◎用较贵。
结合〗物制得后，在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作︽浓度。使用过⊙浓的结合物，既不经济，又可使本底增高;结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓∏度时，能维护＠一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏】度，达到最合适的测定条¤件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的最高稀々释度。例如某一HRP：抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000，表示该制剂ぷ经1:5000稀释后，在与人IgG包被◣的固相作ELISA试验时，将发生阳性反ξ 应。但在用于具体的ELISA检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下◣进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中∩的工作浓度。
