货号：YX-W-A005 规格：100管/96样
柠檬酸合酶（citrate synthase，CS）试剂盒说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物→、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环第一个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。
测定原理：
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A，进↑一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB，在412nm处有特】征吸光值。
需自备的仪器和用』品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移＠ 液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水
试剂组成和配制：
试剂一：液体100mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体20mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体1.5mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体30mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入1mL 蒸馏水，用不完◆的试剂仍-20℃保存；
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
①称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴︻匀浆器或研钵匀浆。
②将匀浆600g，4℃离心5min。
③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
④上清液∑即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS（此步可选做）。
⑤在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒ω 体CS测定。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长▃至412nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1）在试剂五中加ぷ入1mL无水乙醇和22mL试剂四，混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；现配现用；
（2）在微量石英比色皿或96孔板中々加入10μL样本、220μL试剂五和10μL试剂六，混匀，记录412nm处20秒时的初始吸光度A1和2分20秒时的吸光√度A2，计算ΔA=A2-A1。
CS活性计算：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位ζ的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol TNB定◣义为一个酶活力单位。
CS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=880×ΔA÷Cpr
此法需◥要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义』：每g组织每◥分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力★单位。
CS（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（W×V 样÷V 样总）÷T
=177.8×ΔA÷W
（3）按细菌或☆细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力↘单位。
CS（nmol/min/104cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总）÷T
=0.3556×ΔA
V 反总：反应体系总∩体积，2.4×10-4L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×104L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或「细菌总数，500万。
b. 使用96孔板测定的计算公式如下：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T
=1760×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（W ×V 样÷V 样总）÷T
=355.6×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS（nmol/min /104cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总）÷T
=0.711×ΔA
V 反总：反应体系总↙体积，2.4×10-4L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×104L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或◣细菌总数，500万。
