本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗人HSP27单克隆抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶♀标板孔中加入标准品、检测样本和辣根过氧化物酶标记的检测抗体，经过孵育，样本中存在的HSP27与固相抗体和检测抗体结合。洗涤后，加入显色Ψ底物TMB，避光显色。颜色反应的深浅与样本中HSP27的浓度成正比。加入终止液终止反应，在450 nm波长(参考波长570 -630 nm)测定吸光↙度值。

【检验方法】

试剂准备

检测前请将所有的试剂、样本恢复至【室温。 如果浓缩的试剂出现结晶，37℃温浴，直至结晶全部溶解。

1×洗液

吸取20×浓缩洗液30 ml至1 L的量筒，加蒸馏水或去离子水◣至600 ml，轻轻混匀，避免泡 沫。 转移至干ξ　净瓶内。2 - 25℃贮存，1×洗液可稳定30天。

1×检测缓冲卐液

吸取10×浓缩检测缓冲液5 ml至100 ml量筒，加蒸馏水或去离子水至50 ml，轻轻混匀，避 免泡沫。2 - 8℃贮存，1×检测缓冲液可稳定保存30天。

检测抗体◇稀释前充分混匀。根据标准品和待测样本的数量，用1×检测缓冲∞液按1：100稀释浓缩的检 测抗体。 注意：请在30分钟内使用稀释后的检测抗ω体。

辣根过氧化物酶标记的链霉亲和ω　素

稀释前充分混匀。 根据标准品和待测样本的数量，用1×检测缓冲液按1：100稀释浓缩的辣根过氧化物酶标记∩的 链霉亲和素。 注意：请在30分钟内使用稀释后的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

样本稀释

如果样本需要稀释，请用试剂盒◆提供的1×检测缓冲液稀释血清/血浆样本，用细胞培◣养基稀释 细胞培养上清。

人热休克蛋白27标准品

用蒸馏水或去离子水重溶人热休克蛋白27标准品，重溶体积标注在︾人热休克蛋白27标准品的标签上。轻柔 地涡旋震荡，确保充分〒混匀，重溶」后标准品的浓度为4000 pg/ml。重溶后静置10 - 30分钟。稀释 前充分混匀。 请使用聚丙烯管进行标准品稀释。

标准曲线制作∑　血清/血浆Ψ样本标准曲线的制作：

取250μl浓缩的人热←休克蛋白27标准品，加入250μl标准品稀释△液，作为标准曲线的最高浓度(2000 pg/ml)。在每一个试管中加入250μl标准品稀释液。使用＠ 高浓度标准品做1：1系列稀释。每次移 液时，请确保充分混匀。以标准品稀释液作为标准曲线的零浓度。

细胞培养上清〖样本标准曲线的制作：

取250μl浓缩的人热休克蛋█白27标准品，加入250μl细胞◣培养基，作为标准曲线的最高浓度(2000 pg/ml)。在每一个试管中加入250μl细胞培养基。使用高浓度标准品做1：1系列稀释。每次移液 时，确保充分混匀。以细胞培养基作为标准曲线的零

【检测步骤】

检测之前请将所有的试剂∴、样本平衡至室温。

1.准备好所有需ω要的试剂及工作浓度标准品。

2.将不需要的板条拆卸下来，放回装有干燥剂的铝箔袋，重新封好封口。

3.加入300 μl1×洗液静置浸√泡∞30秒。为了获得理想的实验结果浸泡是必须的。弃掉洗液之后，在吸水纸上将微孔板拍干。洗板完成※之后，请立即使用微孔板，不要让微孔板◥干燥◆。

4.复孔加入100 μl2倍倍比稀释的标准品。空白孔复孔加入100 μl1×检测缓冲液。

5.样本孔↑加入90 μl 1×检测缓冲液和10 μl预稀释的样本。

6.每孔加入50 μl稀释的检测抗体。保证步骤4、5、6连续加样，不要间断。加样〗过程在15分钟内完成。

7.使用封」板膜封板。300转/分钟振荡，室温孵育2小时。

8.弃掉液体，每孔加入300 μl洗液洗板，洗涤6次。每次洗板，在吸水纸上拍干。为获得理想的实验性能，必须彻底移除残留液体。

9.每孔加入100 μl显色底物TMB，避光，室温孵育5 -30分钟。

10.每孔加入100 μl终止液。颜色由蓝色变为黄】色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀，请轻轻叩击板框，充分混匀。

11.在30分钟之内，使用酶标仪进行双波长检★测，测定450 nm最大吸收波长和570 nm或630 nm参考波长下的⊙OD值。校准后的OD值为450 nm的测定值减去570 nm或630 nm的测定值。仅使用450 nm测定会导致OD值偏高，并且准确度降低。【结果计算】

计算标准品和样本的①平均OD值，然后减去零浓度标准品的OD值。

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，用计算机软件进行♀回归拟合生成标准曲线。回归分析确定最佳拟合曲线。通过对浓＠ 度值和OD值取对数拟合，可以对标准曲线进行线◥性化。此过程可能可以得到更多样本的浓度，但数据∴的准确度会降低一些。

注意：标准曲线最高浓度点的终浓度为2000 pg/ml。如果完全按照说明书的步骤操作(10 μl样本+ 90 μl检测缓冲液)，计算【样本浓度时请乘以稀释因子10。

如果样本按照说明书进行了稀释，最终√的稀释倍数为1000。如果样本进行了其它方式的稀释，计算样本浓度时请乘以相应的稀释倍数。