酵母基因组DNA快速提取试剂盒
货号 |
规格 |
价格 |
N1161 |
50次 |
555 |
N1162 |
100次 |
990 |
产品组分
组分 |
货号 |
|
N1161 |
N1162 |
|
消化缓冲液DS |
15 ml |
30 ml |
裂解液MS |
20 ml |
40 ml |
蛋白酶K |
1 ml |
2 ml |
去蛋白液PS |
30 ml |
60 ml |
漂洗液PE |
15 ml |
30 ml |
纯化液TE |
5 ml |
10 ml |
DNA纯化柱 |
50个 |
100个 |
说明书 |
1份 |
1份 |
注:裂解液MS中含有变性剂,请不要直接接触皮肤。
漂洗液PE初次使用前用无水乙醇按1: 3稀释,即含75%乙醇。
需要购买的试剂
溶壁酶(东盛货号:N9031、N9032)。
保存条件
蛋白酶K于-20℃保存。
其余试剂置于室温(15-25℃)干燥条件下保存1年。
消化缓冲液DS和裂解液MS中如有沉淀,在55℃加热溶解,待恢复室温后混匀即可使用。不会影响基因组DNA纯化效率。
产品说明
本产品用于酵√母基因组DNA的小量提取。纯化原理是利用细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA,由硅胶膜柱可逆吸附基因组DNA,经蛋白酶消化、漂洗液清洗
除去蛋白质、脂质以∞及多糖等杂质后,用纯化液洗脱获得基因组DNA。本产品可从1-5×107的酵母细胞中提取到3-35 μg 超纯基因组
DNA(OD260/280 = 1.7-1.9)。
产品特点
产品用途
质量控制
纯化的基因组DNA质量通过限制性酶切和单拷基因的PCR扩增鉴定。
酵母基因组DNA提取流程图
图1 酵母基因组DNA纯化流程图
操作方法
1 向每只1.5 ml离心管中加入酵母细胞液1-5 ml(最多不超过5×107个细胞),12,000离心1min,尽量去除上清。
注:菌液较多时,可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。
2 向〖菌体加入600 µl 1 M山梨醇溶液,200 U溶壁酶,漩涡振匀,30℃消化30min。
注:可根据收集菌体量的不同、菌种的差异,溶壁酶比活的不同,相应调整溶壁酶的用量及消化时间。
3 5,000 rpm离心8-10min,去上清,收集沉淀。向收集到的菌体沉淀中加入200 μl消化缓冲液DS,振荡混匀。
注:如需要去除RNA,可加入4 μl RNase A(100 mg/ml)溶液,震荡混匀,室温放置5min。
4 加入20μl蛋白酶K溶液和220μl裂解液MS,漩涡振荡器振荡混匀,直至形成均一的悬浮液。65℃温浴10min。溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的
水珠。
注:加入裂解液MS时可能会产生白色沉淀,一般65℃放置时会消失,不会影响后续实验。如溶液未变清亮,说明酵母细胞裂解不彻底,可能导致提取DNA量少和提取出的
DNA不纯。
如菌体超过1.5 ml,可适当延长温△浴时间。
5 加入220 μl无水乙醇,上下颠倒混匀。此时可能出现絮状沉淀。将溶液及絮状沉淀转移到№纯化柱中。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
注:此时基因组DNA被吸附于DNA纯化柱中的硅№胶膜上。
6 加入500 μl去蛋白液PS。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
注:此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、脂质、多糖等杂质洗脱,以获得高质量基因组DNA。
7 加入500 μl漂洗液PE。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
注:漂洗液PE初次使用前用无水乙醇按1: 3稀释,即含75%乙醇。
8 加入500 μl漂洗液PE。12,000 rpm离心1min,弃滤液。
9 12,000 rpm离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体。
注:此步骤的作用是去除残留乙醇,避免影响后续的酶促反应(PCR或酶切)。同时利于基因组DNA充分溶解。
10 将纯化柱置于新的1.5 ml离心管中。向纯化柱中央处,悬空加入30-100μl洗脱液TE。室温放置2min。于12,000 rpm离心2min,管底即为高纯度基因组DNA。
注:洗脱液TE可用去离子水代替,但其pH需为8.0-8.5。体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。
对洗脱液TE 60℃预热,会提高基因组DNA的产量。
图2 酵母基因组DNA电泳图
注意事项
1 溶壁酶需要客户另行购买(东盛货号:N9031、N9032)。
2 应尽量使用新鲜的菌体,确保提取的基因组DNA不被降解。
3 在操作步骤4中,菌体应充分悬浮,不要残留菌块,避免影响溶菌效果。
4 在操作步骤5种,加入无水乙醇后,可能】会出现絮状沉淀,应将离心管内的溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中,确保基因组DNA的得率。
5 基因组DNA需长期保存时,建议使用纯化⊙液TE。分装后保存于-20℃或-80℃。
基因组DNA的浓度及纯度检测
1 基因组DNA 片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
2 DNA 应在OD260 处有显@ 著吸收峰, OD260 值为1 相当于大约50μg/ml 双链DNA、40 μg/ml 单链DNA。
3 OD260/280比值应为1.7–1.9,如果洗脱时不使用纯化液TE,而使用去离子水,比值会偏低,因为pH 值和离子存在会影响光吸收值,但并不表示纯度低。