EndoFree Plasmid Kit
纯化得到至多10 mg的无内毒素高转染级纯质粒或柯斯质粒DNA
纯化得到的DNA内毒素水平低于0.1 EU/μg
纯化流程快，同时去除内毒素
获得高产量、高拷贝质粒DNA
使用LyseBlue，获得最佳的裂解和高产量的DNA
EndoFree Plasmid Kits基于阴离子交换技术，可快速制备不含内毒素的质粒DNA。QIAfilter Cartridges过滤快速澄清裂解液。制备的DNA纯度超过两次CsCl梯度离心法所得DNA的纯度，适合超转染级纯的应用。EndoFree Plasmid Buffer Set可用于制备10次mega规模或5次giga规模转染级纯质粒或科斯质粒DNA制备。
QIAGEN Plasmid Kit实验流程。
将中和的细菌裂解液↓直接在QIAfilter Cartridge中孵育，之后通过过滤快速使其澄清。在去除内毒素的步骤之后，将澄清的裂解液上样至阴离子交换滤芯，这时质粒DNA在合适的低盐和pH值条件下，选择性结合到々树脂上。RNA、蛋白质、代谢物和其他低分子量杂质在中盐溶液中被洗去，之后用高盐溶液洗脱得①到超纯的质粒DNA。之后通过异丙醇沉淀使DNA脱盐，通过离心收集DNA。
性能
EndoFree Plasmid Kit将高效的内毒素去除步骤整合到质粒纯化流程中，不需要☉额外步骤，也不需用亲和柱去除脂多糖。通过QIAfilter Mega-Giga Cartridge过滤细菌裂解液，并使用重力流QIAGEN-tip阴离子交换柱纯化质粒DNA。产量可达10 mg（Giga）、2.5 mg（Mega）、500 μg（Maxi）DNA。纯化的DNA无内毒素（<0.1 EU/μg DNA）。
选用EndoFree Plasmid Mega Kit而非EndoFree Plasmid Giga Kit纯化低拷贝质粒和科斯质粒，将会得到更好的效果，因为后者需要较大的培养体积，而QIAfilter Mega-Giga Cartridge的容量有限。
EndoFree Plasmid Kits去除细菌在裂解过程中释放的内毒素，内毒素会影响原代细胞和敏感培养细胞的DNA转染。从EndoFree Plasmid Kits得到的无内毒素DNA高度适用于可重复且结果可靠的转染（参见Plasmid purification method versus transfection efficiency和Plasmid purity versus transfection efficiency及表"Endotoxin levels in plasmid preparations"和"EndoFree DNA yields high transfection efficiencies with primary cells"）。QIAGEN超纯无内毒素DNA也适用于基因治疗研究和其他敏感应用。
质粒制备中的内毒素水平*
|
质粒制备方法 |
内毒素（EU?/μg DNA） |
平均转染效率? |
|
EndoFree Plasmid Kit |
0.1 |
154% |
|
QIAGEN Plasmid Kit |
9.3 |
100% |
|
2x CsCl |
2.6 |
99% |
|
Silica-gel slurry |
1230.0 |
24% |
* 宿主菌：大肠杆菌DH5α 质粒：pRSVcat。
? 1 ng LPS = 1.8 EU。
? 根据表中数∩据计算 。
无内毒素DNA转染原代细胞的高转染率*
|
DNA纯化方法 |
转染细胞比例 |
|
EndoFree Plasmid Kit |
21.0% ± 0.93 |
|
QIAGEN Plasmid Kit |
8.1% ± 0.57 |
|
Silica-gel slurry |
5.2% ± 0.74 |
* 原代兔胃壁细胞转染pEGFP-N2（CLONTECH），pEGFP-N2由所示的方法制∮备。使用Effectene Transfection Reagent进行转染。该数据是细胞表达GFP的百分率，由转染48小时后绿色荧光细胞数量确定。转染效率是每种纯化方法制备的超过2个不同的DNA中6–9个复制样本的平均值。（数据由C. Chew and J. Parente提供，Department of Molecular Medicine and Genetics, Medical College of Georgia, Augusta, Georgia, USA.）
原理
纯化的质粒DNA内毒素污染水平取决于所用的纯化方法（参见"Endotoxin levels in plasmid preparations"）。硅胶技术纯化的DNA具有非常高的内毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和两次CsCl超速离心∞可获得相对低水平内毒素的纯DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的内毒素去除步骤，获得<0.1 EU/μg的质粒DNA。
QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊设计的过滤装置，用于代替细菌细胞碱裂解后的离心步骤。QIAfilter Cartridges可完全去除SDS沉淀，清除细菌裂解液，相比离心可大量节约时间，减少1小时的质粒纯化时间。QIAfilter Mega-Giga Cartridges采用内部真空方式轻松高效的清除大量细菌裂解液（注意：该试剂盒不包含瓶子）。
QIAGEN-tips中独特的阴离子交换树脂（不提供EndoFree Plasmid Buffer Set）专为核酸纯化而开发。它卓越的分离性能使得DNA纯度与连续两次CsCl梯度离心获得的DNA纯度相当。由重力流驱动并持续运转的预装QIAGEN-tips，最大限度减少手动制备质粒所需的时间。整个QIAGEN质粒纯化系统不使用有毒物质，如苯酚，氯仿，溴化乙锭和CsCl，最大限度地减少对用户和环境的危害。
内毒素，又称脂多糖或LPS，是大肠杆菌等革兰氏阴性菌细胞膜的组成部分，如大肠杆菌（参见Bacterial cell wall）。内毒素在质粒裂解纯化过程中释放出来，并显著降低内毒素敏感细胞株的转染效率。此外，内毒素与DNA竞争“自由”转染试剂，影响转染实验中质粒DNA的摄取。内毒素也诱导巨噬细胞和B细胞等免疫细胞发生非特异性免疫反应，从而导致转染结果的误读。这些反应包括诱导的蛋白质和脂类，如IL-1和前列腺素等的↘合成。总体而言，内毒素在转染实验中是不可控变量，影响结果的可重复性，使它们难以对比、解读。在基因治疗研究中，内毒素可造成内毒素休克综合症和激活补体级联，干扰研究。
操作流程
在碱性条件下，细菌细胞裂解，使用QIAfilter Mega-Giga Cartridge清除〗粗裂解物。将Endotoxin Removal Buffer加入到过滤后的裂解液中。冰浴后，将纯净的裂解物上样到阴离子交换柱上，在适当的低盐和pH条件下，质粒DNA选择性结合。用中盐缓冲液清除RNA、蛋白质、代谢产物和其他低分子量杂质，超纯质粒DNA被高盐缓冲液洗脱（参见QIAGEN Plasmid Kit procedures）。最后DNA由异丙醇脱盐、沉淀并且离心回收。
应用
使用EndoFree Plasmid Kits纯化的DNA适合多种敏感应用，包括：
转染，包括原代、敏感以及悬浮细胞
基因治疗研究
基因沉默
显微注射
